摘要
番茄（Solanumlycopersicum）易受多种病原菌的侵害，是研究植物患病机理的理想物种。晚疫病是番茄的一种毁灭性病害，发病时会造成严重减产。常规的防治方法存在极大局限性，因此利用基因工程手段发掘有利基因，培育抗病品种尤为重要。基因组上的非编码RNA（Non-codingRNA,ncRNA）在植物对生物胁迫的响应中起着关键作用，它包括微小RNA(MicroRNA,miRNA)、长非编码RNA（Longnon-codingRNA,lncRNA)、小干扰RNA（SmallinterferingRNA,siRNA）等多种类型。miR394属于miRNA家族成员之一，其表达水平在病原菌侵染后会发生显著变化。实验室前期预测了miR394的内源竞争性RNA（CompetingendogenousRNA，ceRNA）：lncRNA40787，lncRNA27177和lncRNA42566。根据晚疫病菌侵染后的表达特性，最终挑选了lncRNA40787进行下一步研究。随后分别过表达和沉默了miR394及lncRNA40787，阐明了miR394与lncRNA40787在番茄抗晚疫病中的作用机制及功能。 首先，为探究miR394在番茄抗晚疫病中起到的作用，本研究通过与植物高效表达载体连接以及短串联靶标模拟技术（Shorttandemtargetmimic,STTM）构建了miR394的过表达及沉默载体。利用瞬时侵染将两种重组载体转入番茄，发现miR394的过表达会降低其靶基因LCR（LeafCurlingResponsiveness,LCR）的转录水平，影响茉莉酸（Jasmonicacid,JA）信号通路的关键基因表达，最终降低番茄对晚疫病感染的抵抗力；沉默后结果则与之相反。证明了miR394的负调控作用。 其次，在获得了miR394相关的三个lncRNAs（lncRNA40787，lncRNA27177和lncRNA42566）的序列后，分析了这三个lncRNAs上存在的内源靶标模拟（Endogenoustargetmimicry,eTM）位点。接种晚疫病菌后对miR394、三个lncRNAs、LCR的表达特性进行分析，发现三个lncRNAs均呈现出明显的上升趋势，miR394被显著抑制，LCR表达模式则与lncRNA40787大致相同。以上结果证明三者确实会对该胁迫做出响应。进一步研究发现，在番茄植株瞬时过表达lncRNA40787后，miR394表达水平显著下降，LCR基因的表达量则明显上升，番茄对晚疫病的抗性得到了提高。该结果初步证明miR394可被lncRNA40787吸附，进而调控靶基因的转录水平，影响番茄对晚疫病的抗性。 最后，构建了lncRNA40787的沉默及突变载体。沉默lncRNA40787后，miR394的表达量显著升高，LCR的表达水平下降。接种晚疫病菌后，番茄叶片的病斑面积和病斑直径明显变大，植株抗病能力降低。为进一步说明lncRNA40787与miR394二者间的直接作用关系，瞬时转入了lncRNA40787突变体载体pBI121-mlncRNA40787，发现miR394在pBI121-mlncRNA40787转化叶片中表达量并无显著差异变化。综合以上结果，我们可以得出结论：miR394的确可以被lncRNA40787吸附。 综上所述，本研究验证了lncRNA40787是miR394的ceRNA，明确了miR394在番茄感染晚疫病后的负调控作用。我们的研究提出了lncRNA40787-miR394-LCR调控网络，为揭示番茄抗晚疫病的分子机制提供了理论基础和参考。
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