摘要
大肠杆菌性腹泻是由大肠杆菌（Escherichiacoli，E.coli）引起的旅行者、儿童及幼龄动物的腹泻，常由产肠毒素性大肠杆菌（EnterotoxigenicEscherichiacoli，ETEC）诱发。ETEC产生的肠毒素通过导致肠道内离子紊乱及水钠潴留，引起仔猪和犊牛严重腹泻，给养殖业造成了巨大经济损失。ETEC发挥致病作用的主要肠毒素为耐热肠毒素(Heat-stableenterotoxin，ST)和不耐热肠毒素(Heat-labileenterotoxin，LT)，近来在细菌性腹泻的犊牛体内分离到产Ⅱ型不耐热肠毒素（TypeⅡHeat-labileenterotoxin，LT-Ⅱ）的ETEC。LT-Ⅱ亚型划分复杂，在人畜之间的感染流行情况有逐年递增的趋势。但对LT-Ⅱ的检测手段较为单一，同时其B亚基与LT-Ⅰ的B亚基有类似的免疫佐剂效应。因此，深入研究LT-Ⅱ的免疫原性和检测方法对防治大肠杆菌引起的腹泻具有重要意义。 本研究着重于ETEC的Ⅱ型不耐热肠毒素，设计引物扩增不含LT-ⅡB亚基信号肽的基因片段，双酶切并连接至pGEX-6p-1和pMAL-c4x表达载体，转化后得到稳定表达重组蛋白的重组大肠杆菌BL21/pGEX-6p-1-LT-Ⅱ-B和BL21/pMAL-c4x-LT-Ⅱ-B。用优化后的表达和纯化条件分别表达获得了重组蛋白rGST-LT-Ⅱ-B（38KDa，包涵体表达）和重组蛋白rMBP-LT-Ⅱ-B（61KDa，可溶性表达）;Westernblot分析证明，两种蛋白可分别与兔抗GST多抗和兔抗MBP多抗反应，亲和层析纯化后重组蛋白条带单一，达到纯化目的。 以弗氏完全佐剂与rMBP-LT-Ⅱ-B充分乳化后，背部皮下免疫BALB/c小鼠，取免疫后的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合。间接酶联免疫吸附(enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)方法筛选融合后的细胞株，经亚克隆后得到3株稳定分泌抗LT-Ⅱ-B单克隆抗体的杂交瘤细胞，分别命名为1C10、2A10和4D4。连续传代后杂交瘤细胞产生的抗体效价稳定，经酶标抗体鉴定3株单抗的轻链均为κ链，1C10株和4D4株单抗的重链为IgG1亚类，2A10株单抗的重链为IgG2b亚类，各杂交瘤细胞上清效价为1∶800～1∶3200，制备的腹水效价为1∶6400～1∶102400。Westernblot证明各株单抗均能与rGST-LT-Ⅱ-B发生特异性反应。阻断ELISA检测结果显示，粗提的LT-Ⅱ天然毒素能阻断3株单抗与rGST-LT-H-B的结合，而LT-Ⅰ、STa、Stx2e、Stx1、Stx2等毒素的阻断率均低于50％，说明3株单抗不与其他毒素发生反应，特异性良好。利用Y-1细胞进行中和实验，结果表明1C10、2A10和4D4单抗都具有针对LT-Ⅱ的中和活性，中和效价分别为1∶71、1∶22、1∶40。 为了精确鉴定各单抗识别的LT-Ⅱ-B抗原表位，人工合成9段覆盖LT-Ⅱ-B的多肽作为抗原包被，利用间接ELISA方法鉴定不同单抗的识别位点。最终确定mAb-1C10识别的抗原表位为51-GGQYYPDNYL-60，mAb-2A10识别的抗原表位为31-NKDSK-35，mAb-4D4识别的抗原表位为86-YTPNHVWAIELAP-98。利用Protean软件和在线网站对抗原表位的空间结构分析显示，各单抗识别的抗原表位均位于亲水性和抗原指数较高的区域，呈弯曲线性结构。3段抗原表位与LT-Ⅰ没有同源性，31-NKDSK-35表位在LT-Ⅱc的6个亚类中高度保守，与LT-Ⅱa和LT-Ⅱb没有同源性;51-GGQYYPDNYL-60表位和86-YTPNHVWAIELAP-98表位在LT-Ⅱc1和LT-Ⅱc5中高度保守，在LT-Ⅱc2、LT-Ⅱc3、LT-Ⅱc4和LT-Ⅱc6中存在1～2个氨基酸(aminoacid，aa)位点的突变，这两个表位与LT-Ⅱa和LT-Ⅱb同源性较低。 以rGST-LT-Ⅱ-B作为包被抗原，用mAb-1C10作为检测抗体初步建立了检测LT-Ⅱ的阻断ELISA方法。以最高阻断率为前提对各步反应程序进行优化，结果显示，最佳抗原包被浓度为1μg/mL，检测抗体mAb-1C10最佳稀释倍数为1∶800，HRP标记二抗最佳工作浓度为1∶10000，最适孵育时间为30min，最佳封闭时间、阻断时间和显色时间分别为2h、1h30min和15min，阻断率临界值为53.15％，特异性和重复性良好，对粗提LT-Ⅱ最低检出量为1mg/mL。 综上所述，本研究表达了rMBP-LT-Ⅱ-B和rGST-LT-Ⅱ-B，制备并筛选出1C10、2A10和4D4三株稳定分泌高效价抗体的杂交瘤细胞株，三株单抗对LT-Ⅱ都具有中和活性，鉴定了3株单抗识别的抗原表位，初步建立了检测LT-Ⅱ的阻断ELISA方法，为LT-Ⅱ的检测，表位疫苗的研制及新型佐剂的开发奠定了基础。
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