摘要
研究背景 糖尿病肾病(diabeticnephropathy,DN)是糖尿病(diabetesmellitus，DM)常见而严重的慢性并发症之一，是终末期肾病的主要原因;也是DM患者全因死亡率和心血管死亡率升高的主要原因。DN的临床特征表现为尿白蛋白排泄增加和肾功能持续减退。DN患者的肾功能减退、疾病进展与肾小管间质的损伤密切相关，但是在DN中肾小管损伤的机制还未完全阐明。研究表明，肾脏其他固有细胞可诱导肾小管间质的损伤。细胞外囊泡（extracellularvesicles，EVs）是细胞分泌至胞外的膜结构囊泡，是细胞间通讯的关键媒介。MicroRNA(miRNA)是EVs重要的荷载物质，已被证实广泛参与多种疾病的病理生理过程。近年来，研究发现EVs在DN的发生发展中起到重要作用，EVs荷载的miRNA在DN中的作用也在被逐渐揭示。但在DN的发生及进展中，足细胞EVs对近端肾小管上皮细胞的作用及其机制尚不明确。 研究目的 探讨高糖刺激足细胞分泌的EVs对近端肾小管上皮细胞的作用及其相关机制。 研究方法 使用ExoQuick-TC试剂盒从足细胞培养上清液中提取EVs，通过透射电镜、纳米颗粒追踪分析(nanoparticletrackinganalysis，NTA)和westernblot实验来鉴定EVs。使用绿色荧光染料PKH67标记EVs，将标记的EVs与近端肾小管上皮细胞共培养，通过共聚焦显微镜观察EVs是否被肾小管上皮细胞摄取。通过流式细胞术和TUNEL染色实验来观察高糖刺激足细胞分泌的EVs对肾小管上皮细胞的作用。使用高通量测序技术筛选出高糖刺激足细胞源EVs的差异表达miRNA，并利用生物信息学分析探讨差异表达miRNA在细胞内可能发挥的功能与参与的信号通路。向足细胞内转染let-7f-2-3pinhibitor，提取转染后用高糖刺激的足细胞分泌的EVs，通过流式细胞术观察转染let-7f-2-3pinhibitor后高糖刺激足细胞源EVs对近端肾小管上皮细胞的作用。 研究结果 透射电镜观察到EVs的典型形态结构，NTA检测EVs的平均粒径在150nm左右，westernblot检测出EVs的标志蛋白。共聚焦显微镜下观察到肾小管上皮细胞胞质分布有绿色荧光。流式细胞术和TUNEL染色结果显示高糖刺激下足细胞源EVs组的肾小管上皮细胞凋亡增加。从足细胞EVs的miRNA高通量测序结果中筛选出5个高糖下差异表达的miRNAs(mmu-miR-1981-3p、mmu-miR-3474、mmu-miR-7224-3p、mmu-miR-6538和mmu-let-7f-2-3p)，靶基因富集分析结果可见与促凋亡和促损伤相关的生物学过程，以及与DN相关的信号通路。流式细胞术结果显示，与不转染或转染inhibitorNC后高糖刺激足细胞源EVs组相比，转染let-7f-2-3pinhibitor后高糖刺激足细胞源EVs组的肾小管上皮细胞凋亡减少。 结论 高糖刺激下足细胞通过分泌富含let-7f-2-3p的EVs诱导近端肾小管上皮细胞凋亡。
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