摘要
红曲色素作为天然色素广泛的应用于食品、药品中，其作为一种安全、营养的天然色素，具有良好的经济效益。红曲色素种类繁多，根据色调分为红曲橙色素、红曲黄色素和红曲红色素。目前，已知的红曲色素化学结构主要集中在6种醇溶性和4种水溶性色素。研究发现红曲色素生物合成是通过FAS和PKS聚酮途径进行的，需要大量的初级代谢物，如乙酰辅酶A、丙二酰辅酶A和NAD(P)H，整个代谢通路存在较多的氧化还原反应，涉及NAD(P)H的参与;红曲霉作为耗氧型丝状真菌，扰动电子传递链必定会改变辅因子代谢途径，改变胞内还原力平衡。基于此，本课题首先利用液态发酵技术即在发酵液中添加外源因子调控红曲色素合成，研究外源因子对色素产量的影响;其次，通过Blast基因分析挖掘电子传递链complexⅠ上的nuoⅠ基因，定向扰动complexⅠ通路上nuoⅠ的调控途径，提升红曲霉菌的色素产量，再结合基因组学和RNA-seq分析解析辅因子对红曲霉菌色素合成的调控机制。本实验旨在阐明辅因子代谢与色素合成的关系，为完善色素合成调控机制的研究提供理论基础，并可能开发出提高色素产量的新方法和工程菌株。论文的主要研究内容如下: (1)外源因子调控红曲色素合成 本实验以从红曲米中分离的紫色红曲LQ-6（MonascuspurpureusLQ-6）作为亲本菌株(保藏于中国武汉的中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCCM2018600)。在液态分批发酵培养基中分别加入甲基紫精(MV)、鱼藤酮和人工合成辅因子进行发酵调控。结果显示，外源添加1mg/L甲基紫精、1mg/L鱼藤酮以及50mg/L合成辅因子后，总色素产量分别达到170.51U/mL、172.87U/mL和171.82U/mL，与亲本菌株紫色红曲LQ-6相比分别提高了39％、40.92％和40.06％，并且添加1mg/L甲基紫精和鱼藤酮显著提高了黄色红曲色素的产量，产量分别为77.53U/mL、97.74U/mL，与亲本菌株紫色红曲LQ-6相比分别提高了69.76％以及114.01％;而外源添加50mg/L合成辅因子显著增加了红色红曲色素的产量，其产量为67.60U/mL，相比亲本菌株提高了90.74％。 (2)定向扰动电子传递链调控红曲色素合成 在亲本菌株LQ-6全基因组测序基础上，本课题通过Blast基因分析挖掘电子传递链complexⅠ上的nuoⅠ基因，定向扰动complexⅠ通路上nuoⅠ的调控途径，扰动辅因子代谢调控红曲色素合成，解析辅因子合成对红曲色素合成代谢的调控作用。通过对出发菌株M.purpureusLQ-6以及工程菌株M.purpureus△4971胞内色素、胞外色素、NADH(NADPH)、生物量以及糖耗等指标的测定，考察不完全敲除nuoⅠ基因后对菌株生长的影响以及色素变化的情况。利用基因工程手段扰动编码NADH-quinone氧化还原酶的nuoⅠ基因后，工程菌株M.purpureus△4971发酵培养基中总色素产量为166.21U/mL，相比原始菌株M.purpureusLQ-6的122.70U/mL提高了35.46％，其中黄色素产量为70.72U/mL、橙色素产量为56.81U/mL和红色素产量为38.66U/mL，相较于亲本菌株分别54.86％、36.68％和9.1％。M.purpureusLQ-6桔霉素的产量为1.70mg/L，工程菌株M.purpureus△4971的桔霉素的产量提高到1.80mg/L，提高了5.88％。且基因工程菌株M.purpureus△4971在生长对数期，其NADH和NADPH分别显著增加1.29和1.61倍;此外其生长速度、生物量以及糖耗速率前期略低于亲本菌株，于84h以后开始慢慢呈现增长的趋势。 (3)辅因子调控红曲色素合成的调控机制初探 比较转录组结果显示，弱化nuoⅠ基因后，筛选出FDR＜0.05且|log2FC|＞1的基因作为显著差异基因(DEG)，一共有1109个基因在mRNA表达水平上具有显著差异。与亲本菌株M.purpureusLQ-6相比，工程菌株M.purpureus△4971中表达上调的有193个基因，表达下调共有916个基因，结果表明，扰动辅因子代谢，相较于亲本M.purpureusLQ-6，工程菌株M.purpureus△4971的糖酵解途径、脂肪酸合成途径、桔霉素和色素合成途径等相关基因基因显著上调，而在TCA循环、脂肪酸降解、PKS途径、电子传递链途径等表达水平显著下调。其电子传递链的相关基因NADHdehydrogenase、ETCcomplexⅠsubunitconservedregion-domain-containingprotein、NADH:ubiquinoneoxidoreductase、gNADHdehydrogenase、NADH-ubiquinoneoxidoreductase表达量显著降低。桔霉素途径中ctnC、mrl5、ctnD、ctnB、ctnA、ctnS(pksCT)、ctnF、ctnH等基因上调显著。色素显著上调基因主要为MPsGeF、MPsGeC、MPsGeA、MPsGeM、MPsGeK、MPsGeJ。所干扰的4971基因在转录组学中命名为gene-MPDQ_006632，其log2Ratio(△4971/WT)=-0.41，证明干扰该基因后其表达量降低，qRT-PCR验证验证结果与转录分析一致。结合不完全敲除nuoⅠ基因工程菌株的色素合成情况、动力学分析及其生理特性分析，为完善色素合成调控机制的研究提供理论基础。
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