摘要
苦荞不仅具有较高的营养价值，而且抗非生物胁迫能力极强，在食品行业、饲料行业和医药行业等方向都受到较高的关注，也可作为挖掘抗逆基因的优质材料。随着盐碱土地面积的扩大，培育耐盐能力强的品种是解决土地最大化利用的关键步骤之一。本研究以不同来源的268份苦荞种质为材料，利用NaCl进行处理，观察苦荞种质在萌发时期对盐胁迫的响应情况，并进行种质筛选。用已进行10倍重测序的材料(197份)与耐盐指标的总隶属函数值进行全基因组关联分析，初步定位与耐盐性状相关的候选区域。再通过候选基因的表达量和SNPs分析筛选候选基因。对候选基因进行生物信息学分析，并构建过表达载体，在苦荞毛状根和拟南芥中鉴定转基因材料对盐压力的反应。这为进一步挖掘苦荞耐盐基因、完善苦荞耐盐机理和苦荞耐逆品种的开发奠定分子基础。本研究的主要结果如下： 1、利用三个耐盐相关性状的总隶属函数值对268份材料进行综合耐盐能力评估。结果表明，随着NaCl浓度的增加，对种子发芽率、胚根长和上胚轴长的抑制效果越明显；其中总隶属函数值gt;1.5的有24份，lt;0.7的有17份，表明24份对盐不敏感；有17份对盐敏感。 2、用197份材料(已进行重测序)的总隶属函数值单独进行分析，发现其总隶属函数值主要集中分布在上四分位点(1.29)和下四分位点(0.92)之间，上四分位点以上和下四分位点以下的材料数较少，总体呈正态分布的趋势。用197份材料的总隶属函数值与基因型数据进行GWAS关联分析。在第6号染色体上出现一个最高峰(Ft6:18420318)，并对其进行基因分型，结果显示两个单倍型的表型数据呈显著差异。将-log10(p)≥5的区域视为耐盐候选区域，挑选最高点左右两翼100kb内的基因为候选基因。通过基因注释、NaCl诱导表达量分析和SNPs分析，筛选出两个候选基因FtPinG0606594100.01和FtPinG0606596500.01，分别命名为FtMGT2L和Ft2OGoxygenases1。FtMGT2L基因起始于第六号染色体的Ft6:18327628，终止于Ft6:18332564，共4936bp，CDS长1326bp，编码441个氨基酸。Ft2OGoxygenases1基因起始于第六号染色体Ft:18413012，终止于Ft:18417968，全长4956bp，CDS长999bp，编码332个氨基酸。 3、通过组织特异性分析表明，FtMGT2L在叶和茎中响应明显，Ft2OGoxygenases1在花和果实中的表达量较高。利用在线平台对候选基因进行亚细胞定位分析，结果表明，FtMGT2L和Ft2OGoxygenases1在细胞质中的概率最大。系统进化树分析表明FtMGT2L与拟南芥的AtMGT2关系紧密，是一种Mg2+通道蛋白，能有效提高植株耐逆性。Ft2OGoxygenases1所属的酶基因家族在维护细胞稳态中也起重要作用，但大多数该家族基因的功能研究较少，还需要进一步验证。 4、克隆两个候选基因，并连接到pCAMBIA1302过表达载体上，通过农感菌介导的遗传转化法分别转入苦荞毛状根和拟南芥中鉴定其耐盐性。(1)NaCl胁迫对异位表达拟南芥萌发的影响：NaCl胁迫抑制了拟南芥的生长，使得植株矮小，叶片呈浅黄色，根系短小，无侧根生长。FtMGT2L异位表达植株的发芽率(70%左右)高于对照(62%)，植株根长和苗长没有显著差别。而Ft2OGoxygenases1异位表达植株根系生长在胁迫下受到的危害压力低于野生型植株。(2)对拟南芥幼苗进行1周盐胁迫处理后，野生型植株下部莲座叶大多枯死，受害程度最大。而过表达植株叶片正常，呈深绿色，有少数叶片枯黄。对其叶片进行DAB染色，观察得出，野生型植株大面积被染成红色，阳性对照植株叶片部分面积呈红色，过表达株系小面积出现点状红色斑点。异位表达FtMGT2L拟南芥，在盐胁迫下，SOD和CAT活性增长量显著高于对照。异位表达Ft2OGoxygenases1拟南芥的SOD活性增长量也显著高于对照。这结果与过表达毛状根的结果相似。
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