摘要
甾醇药物是仅次于抗生素的第二大类药物，在治疗和预防各种疾病中起着重要作用。4-雄烯-3,17-二酮（AD），1,4-雄二烯-3,17-二酮（ADD），9α-羟基雄烯二酮（9-OHAD），9β,11β-环氧-17α,21-二羟基-16β-甲基孕-1,4-二烯-3,20-二酮（Δ1,2-EP）等都是非常有价值的甾醇药物中间体，可用于生产多种激素类药物。 分枝杆菌可以通过降解植物甾醇获得9-OHAD。为了构建高产9-OHAD的分枝杆菌菌株，我们分析了MycobacteriumneoaurumMS136菌株降解植物甾醇向9-OHAD转化过程中一些重要基因的表达响应。通过过表达对植物甾醇响应明显上调的基因（hsd，cyp125，fadD19，hsd4A和ksh）来检测其对9-OHAD产量的影响。最后，选择四个关键基因（hsd，hsd4A，kshA1和kshB）过表达，并敲除导致不利于9-OHAD积累的kstd基因构建重组MycobacteriumneoaurumMS136-F菌株。以13.0g/L的商业植物甾醇（包括6.2g/L的β-谷甾醇，3.0g/L的菜油甾醇，3.3g/L的豆甾醇和0.5g/L的其他物质）为底物发酵，在发酵第108小时后获得了6.8g/L的9-OHAD，是出发菌株M.neoaurumMS136（9-OHAD产量为4.7g/L）的1.45倍。在植物甾醇原料中，β-谷甾醇和菜油甾醇均被完全降解并以98.5％的高摩尔转化率转化为9-OHAD，但豆甾醇降解困难，只有0.3g/L被菌株所利用。 本研究还比较了15个组成型启动子和49个核糖体结合位点序列（RBS）在MycobacteriumneoaurumATCC25795中对基因表达的调控能力。验证了大肠杆菌来源的trp，trc，tac和tic启动子在分枝杆菌中调控基因表达的能力。确认了来自枯草芽孢杆菌的启动子pm2及截断pm2启动子后所获得的启动子pms，分枝杆菌弱启动子hsp70和十个串联启动子（CP1-10）在分枝杆菌中调控基因表达的能力。其中，串联启动子CP6调控基因表达的能力强于hsp60启动子。基于RBS预测软件和iGEM信息设计构建了一个含有49个RBS的文库，并检测了它们在分枝杆菌中调控基因的能力。RBS的文库含有38个强于对照RBS的序列和11个弱于对照RBS的序列。发现富含A/U碱基的RBS可以增加mRNA的稳定性和翻译效率。通过使用含有中等强度RBS序列（R1）和强启动子（CP6）的基因表达盒来驱动ksh基因过表达，可通过增强ksh基因表达使9-OHAD产量提高到5.72g/L，是原始菌株（4.58g/L）的1.24倍。此外，在利用中等强度RBS序列（R1）和强启动子（CP6）的基因表达盒来驱动hsd，hsd4A和ksh基因在M.neoaurumMS136菌株中的表达能力比原始的hsp60启动子和Mrbs序列强，能够明显缩短发酵的时间。 甾醇C-1,2位脱氢是甾药生产中的一个重要反应，直接利用分枝杆菌进行脱氢反应存在易使产物形成不稳定结构、乙醇做促溶剂的耐受性低等缺点，因此我们选择酿酒酵母作为底盘细胞。3-酮类固醇-Δ1,2-脱氢酶（KSTD）在甾醇C-1,2位脱氢反应中起重要作用。KSTD是一种FAD辅酶，外源添加FAD可以提高酶催化反应效率，但是成本过高不利于工业生产。FAD合成途径的工程改造可以显著增加其胞内浓度并改善生物催化反应。此外，为了保证酶催化反应的持续性，维持其高效性，还需要实现FAD的循环再生。在这项研究中，我们将枯草芽孢杆菌中的FAD合成基因整合到酿酒酵母基因组中，用以提高胞内FAD含量，同时添加了甲酸脱氢酶和NADH氧化酶促进FAD再生。最后通过表达3-酮类固醇-Δ1,2-脱氢酶，成功构建了酿酒酵母甾醇C-1,2脱氢反应体系，使底物AD和9β,11β-环氧-17α,21-二羟基-16β-甲基孕-4-烯-3,20-二酮（EPA）的生物转化率有了明显提升。
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