摘要
温室效应的发生和化石燃料的不可再生性，对可持续发展提出了挑战，生物质燃料特别是木质纤维素生物质成为了替代方案之一。从木质纤维素生物质生产生物燃料和生物基化学品，减轻对原油的依赖以及石油衍生产品对环境的影响，受到了广泛关注。转化生物质的典型方法包括热化学法和生物转化，纤维素酶是木质纤维素生物质进行生物转化的先决条件，纤维素组分的酶水解是木质纤维素生物质生物精制的瓶颈之一，纤维素酶的高生产成本和低降解效率成为工业生产的巨大挑战。 里氏木霉TrichodermareeseiRUTC30是生产纤维素酶最广泛使用的真菌之一，但是仍然存在生产成本高、生产菌种易退化，退化后产酶能力降低等问题。通过对商品纤维素酶和里氏木霉RUTC30发酵液的蛋白质鉴定和酶活分析，发现发酵液中的CBH1、EGL1、SWOL和CIP1含量占比与商品酶相差较多，需增加这四种蛋白在复合纤维素酶中的含量；而XYR1（木聚糖酶调节剂1）是关键转录激活因子，在纤维素酶和木聚糖酶编码基因的启动子区域存在多个XYR1结合位点，纤维素分解和木聚糖分解基因的表达是由XYR1等转录因子协调调控。本研究选取了同源基因cbh1、egl1、cip1、swol和xyr1作为目的基因在里氏木霉RUTC30中过表达，从分子水平优化纤维素酶酶系，提高里氏木霉纤维素酶的降解效率。 农杆菌AGL-1菌株内携带有无自身转运功能的琥珀碱型Ti质粒，所含有的Vir基因可以特异性识别并切割质粒的上、下游片段，促使目的基因随机插入宿主菌染色体中。将外源重组载体转化入里氏木霉细胞中的方法转化成功率普遍偏低，且耗材价格昂贵，农杆菌转化法可以提高其转化效率。本文利用根瘤农杆菌介导的里氏木霉遗传转化法，从分子水平强化酶系中重要蛋白组分的表达，成功扩增了含有目的基因的重组质粒，并将其顺利电转入农杆菌，进而实现了目的基因插入到里氏木霉的染色体DNA中，最终获得了过表达CBH1、EGL1、CIP1、XYR1和SWOL基因的里氏木霉改造菌株。 利用摇瓶发酵的方法对所有阳性转化子的酶活进行初步比较，从31株改造菌中筛选出最优转化子T.reesei-EGL1-6和T.reesei-SWOL-9，其滤纸酶活分别达到了1.045FPU/mL和1.254FPU/mL，比野生型分别提高了30.95%和57.14%。使用批式流加补料的方法对最优转化子进一步发酵分析，其中swol-9的滤纸酶活、β-葡萄糖苷酶酶活和木聚糖酶酶活与野生型相比分别提高了49.54%，9.36%和36.9%；转化子egl1-6的滤纸酶活、β-葡萄糖苷酶酶活和木聚糖酶酶活与野生型相比也分别提高了35.12%，3.55%和18.76%。这表明膨胀素的过表达可以扩张纤维素的内部结构，使纤维素酶与木质纤维素更加充分地接触和参与降解反应。内切葡聚糖酶作为纤维素酶的三大主要成分之一，其表达量的增加对于提高纤维素酶酶活效果同样显著。 本研究成功地将农杆菌介导的共转化技术运用到了目标菌株中，得到的高产纤维素酶菌株工业化生产纤维素酶存在着重大的意义。
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