摘要
【研究背景】 皮肤是人体最重要的器官之一，而皮肤损伤可以广泛地发生在各个年龄阶段的人群中。而口颌面系统的皮肤损伤不仅严重地影响着机体的稳态，更会给人们的面部美观造成巨大的心理负担，带来一系列的社会和经济问题。不断探索更加有效的治疗策略和方案，阐明治疗环节中的关键调控机制是当前组织修复与再生医学研究中的热点和难点。 近年来，间充质干细胞（Mesenchymalstemcells,MSCs）治疗已经在各种疾病中得到了广泛的应用。MSCs移植能够有效地治疗类风湿性关节炎、心肌梗死、肝纤维化、多发性硬化病和系统性红斑狼疮等多种疾病。我们实验室前期的研究结果也证实，MSCs治疗可以有效地缓解皮肤组织愈合过程中的瘢痕形成，并且能够提高皮肤创面的愈合速率和质量。而在目前的MSCs治疗中，关于MSCs产生治疗作用的机制一直是研究者们关注的重点。前期研究显示，MSCs在移植进入宿主体内后，可以分化成为多种成体细胞并与宿主的组织进行整合从而发挥其疗效。同时，也有研究表明，在大多数情况下移植的MSCs并不会直接分化成为宿主成体细胞参与组织的修复与再生，而是通过旁分泌包括PGE2、VEGF、IL-4等多种促修复或免疫调节因子来产生疗效。目前，尽管MSCs治疗的具体机制已经得到了部分阐明，但是对其治疗中观察到的一些现象仍存在一定的解释盲区，需要进一步的探讨和研究。而在这其中发现的有趣现象是，MSCs移植之后短时间内发生了大量细胞凋亡，而MSCs移植的疗效却依然存在。这些证据显示MSCs治疗并不仅仅是依靠上述已发现的机制，很有可能是这些凋亡的MSCs产生了治疗作用，而目前这种“凋亡促再生”的治疗机制尚待深入研究。 MSCs在移植进入宿主组织内后，会释放细胞外囊泡（Extracellularvesicles,EVs），而EVs是一种由细胞分泌的介导细胞之间信号交流和调控的物质。目前，MSCs来源的EVs在维持机体稳态和疾病诊疗中的作用正逐渐受到关注，其重要机理也在不断地被揭开。值得注意的是，移植的MSCs在进入宿主体内组织后会很快地发生凋亡，而凋亡过程中的MSCs会释放特异性的凋亡细胞外囊泡（Apoptoticextracellularvesicles,ApoEVs），因此阐明ApoEVs在组织修复与再生中潜在的调控作用具有很重要的研究价值。 当前关于MSCs治疗的可能机制存在多种假说，其中促进组织修复与再生过程中的血管化是最为关键的策略之一，而增强内皮细胞(Endothelialcells,ECs)的成血管功能是促进组织血管化的重要基础。同样，细胞自噬是调控并促进ECs成血管功能的重要途径，其是通过细胞内形成自噬溶酶体来降解错误折叠蛋白和受损的细胞器，并循环利用以维持细胞的代谢平衡和功能稳态。综上所述，本研究提出假设：在骨髓间充质干细胞（Bonemarrowmesenchymalstemcells，BMMSCs）治疗的过程中，移植的BMMSCs进入宿主体内组织后发生凋亡并特异性地释放ApoEVs，ECs摄取ApoEVs后激活细胞自噬并增强其成血管功能，进而促进组织愈合过程中的血管化水平。目前关于ApoEVs生物学作用的研究仍然甚少，探讨关于凋亡BMMSCs来源的ApoEVs经自噬途径增强ECs的成血管功能从而促进组织血管化的研究具有重要的理论意义和实践应用价值。 【研究目的】 本研究拟基于皮肤缺损模型研究MSCs治疗的新机制，阐明移植BMMSCs在凋亡过程中释放ApoEVs并增加ECs溶酶体的活性和数量，探讨ApoEVs促进TFEB蛋白表达增加及核内转移并激活ECs自噬的现象，解析ApoEVs经ECs自噬增强其成血管功能并介导促进新生组织血管化的重要作用和机制。本研究将为深入认识MSCs治疗的机制，阐明MSCs经EVs释放介导细胞间信号交流和促进组织修复再生，以及建立基于EVs治疗的新型策略提供有力的实验依据和重要理论支撑。 【研究方法】 1.BMMSCs的分离培养鉴定及治疗效果验证。首先，本实验采用全骨髓冲洗法培养大鼠BMMSCs。其次，利用流式细胞术对BMMSCs的表面标志物进行检测鉴定。进一步，我们利用结晶紫染色和MTT实验对BMMSCs的克隆形成能力和细胞增殖能力进行检测验证。随后，我们通过ALP染色、茜素红染色、油红O染色以及westernblot等方法进一步验证BMMSCs的多向分化能力。最后，我们成功建立了皮肤创面愈合模型并对BMMSCs的治疗作用进行评估，观察BMMSCs注射治疗之后第7天和第14天时皮肤创面的愈合情况，利用Hamp;E和Masson等染色方法观察组织愈合的效果。另外，我们利用免疫荧光染色观察了BMMSCs注射进入宿主体内组织之后的存活情况，并观察细胞凋亡状态。 2.ApoEVs的分离提取鉴定及其对ECs成血管作用的检测。首先，本实验采用诱导后的梯度离心法收集BMMSCs凋亡过程中释放的ApoEVs，并通过扫描电镜、粒径分析仪、免疫荧光染色和westernblot等方法对ApoEVs进行了表征和鉴定。进一步，我们在体外收集了ApoEVs并将其注入皮肤缺损模型中，观察注射治疗后第7天和第14天时皮肤创面的愈合情况，并利用Hamp;E和Masson等染色方法观察愈合的效果，再利用免疫荧光染色检测皮肤愈合处新生血管相关因子CD31的表达情况。最后，我们利用体外实验模型，直接观察ApoEVs在ECs的增殖、迁移、管腔形成能力和成血管相关基因表达等方面发挥的作用与影响。 3.ApoEVs对ECs溶酶体的影响及TFEB对ECs成血管作用的体外实验评估。为了进一步研究ApoEVs对于ECs的作用机制，我们利用免疫荧光染色及RT-qPCR技术检测了ApoEVs对于ECs溶酶体的影响并分析其数量和活性的变化。同时，利用westernblot及免疫荧光染色技术观察了关键调节分子TFEB的核内转移变化情况。最后，我们通过转染si-TFEB下调其在ECs内的蛋白表达水平，检测TFEB在由ApoEVs介导促进的ECs增殖、迁移和管腔形成能力等方面中发挥的作用。 4.自噬对于由ApoEVs介导的促进ECs成血管功能的影响。首先，我们通过westernblot和RT-qPCR等方法检测ApoEVs对ECs自噬相关基因和蛋白的表达影响。进一步，我们利用westernblot和免疫荧光染色等方法检测了ApoEVs对ECs自噬流变化的影响以及TFEB在由ApoEVs介导的增加ECs自噬中的作用。同时，我们利用体外实验模型观察了自噬在由ApoEVs介导的增强ECs增殖、迁移和管腔形成能力等方面中的作用。最后，我们在体内实验中，通过Hamp;E和Masson等组织学染色和免疫荧光染色等技术方法，验证了自噬在ApoEVs介导的促进皮肤血管化中的作用。 【研究结果】 1.成功分离培养的BMMSCs呈梭形生长，间充质干细胞表面标志物呈阳性且造血干细胞表面标志物呈阴性。培养的BMMSCs具有一定的自我更新能力和成骨成脂等多向分化能力。同时，与对照组注射PBS缓冲液相比，注射BMMSCs悬液能够有效地促进皮肤创面的愈合。值得注意的是，BMMSCs注射之后短时间内其数量骤减，并且发生大量的细胞凋亡。 2.在凋亡的BMMSCs中分离出由其释放的ApoEVs，并利用体内皮肤缺损模型验证发现，ApoEVs局部注射同样能够有效地促进皮肤创面愈合并增加组织内新生血管的数量。为研究ApoEVs对于血管化的直接影响，经过体外实验观察发现，ApoEVs能够促进ECs的成血管功能，增强其增殖、迁移和管腔形成能力并上调成血管相关基因的表达等。 3.利用荧光标记并追踪ApoEVs，发现其能够与ECs溶酶体进行共定位，ApoEVs作用于溶酶体能够提高其活性并增加其数量。进一步研究发现，ApoEVs能够上调ECs中关键分子TFEB的表达并促进其由细胞质向细胞核内转移。随后，为证明ApoEVs的作用是由TFEB介导的，利用siRNA靶向抑制TFEB分子的表达，发现其可以阻断ApoEVs对ECs成血管功能的促进作用。 4.通过RT-qPCR和westernblot等实验验证发现，ApoEVs能够提高ECs自噬相关基因的表达。同时，通过免疫荧光染色观察ECs的自噬流变化也证实了此结果。进一步，利用siRNA靶向抑制实验发现，TFEB对ECs自噬相关蛋白的表达存在重要影响，并且ApoEVs对于ECs自噬水平的促进作用是通过TFEB介导的。最后，利用体内模型验证发现，自噬介导了ApoEVs对于皮肤创面愈合过程中血管化的促进作用，从而加速了皮肤创伤后的修复与再生。 【研究结论】 1.BMMSCs治疗能够有效地促进皮肤创面的愈合，但同时BMMSCs移植后会在宿主体内发生大量的细胞凋亡。 2.BMMSCs在凋亡时会释放大量特异性的ApoEVs，而ApoEVs能够直接作用于ECs并增强其成血管功能，促进皮肤愈合过程中的组织血管化，从而提高皮肤缺损修复的治疗效果。 3.BMMSCs凋亡过程中释放的ApoEVs能够被ECs所摄取并激活溶酶体，增加其活性和数量。同时，ApoEVs能够增加ECs中TFEB的表达并促进TFEB分子由细胞质向细胞核内转移。而TFEB能够介导ApoEVs对ECs成血管功能的促进作用。 4.关键分子TFEB能够直接调控ECs自噬相关基因和蛋白的表达，而自噬又能够促进ECs的成血管功能。因此，ApoEVs能够通过TFEB促进ECs自噬并增强其成血管功能，从而提高新生皮肤组织的血管化水平。
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