摘要
叶片是植物的主要光合器官，也是土壤表层以上环境因子的主要调节者。叶片的形态发生和分化是个高度灵活的过程，从而导致叶形的多样性。而叶片变异是植物叶片多样性方面最突出的一面。番茄（Solanumlycopersium）是全世界最重要的园艺作物之一，也是研究植物生长发育的模式植物。Aux/IAA基因家族成员涉及到植物生长发育的多个方面，SlIAA9基因是Aux/IAA基因家族成员之一。前人研究结果表明SlIAA9-RNAi转基因番茄株系表现为果实单性结实和单叶等表型。entire突变体是SlIAA9基因CDS区域第626bp处单碱基C缺失形成的突变体，该突变体也表现为单叶。前人研究结果表明Aux/IAAs蛋白和ARFs蛋白互作具有不同的生物学功能。 本研究通过酵母双杂交筛选出与SlIAA9互作的候选SlARFs蛋白，通过病毒诱导基因沉默（VIGS）技术初步分析其在调控叶片发育方面的功能。主要研究结果如下： 1、酵母双杂交、双分子荧光互补试验和pull-down试验结果表明，SlIAA9与SlARF6A、SlARF8A、SlARF8B及SlARF24蛋白互作。 2、SlARFs基因家族成员在复叶材料AC及单叶材料entire突变体中的表达量分析，结果表明entire突变体改变了多个SlARFs基因的表达模式。 3、为初步筛选候选SlARF6A、SlARF8A、SlARF8B及SlARF24基因的功能，利用VIGS技术分别沉默这4个候选基因中的1个、2个、3个及4个基因。发现只有同时沉默掉这4个候选基因时，entire突变体的叶形由单叶转变为一定程度的复叶，出现了一定程度的表型恢复。因此，我们推测，同时沉默SlARF6A、SlARF8A、SlARF8B及SlARF24基因时，可以使entire突变体出现一定程度的表型恢复。此外，与entire突变体相比，该材料中的IAA含量显著增加。 4、为进一步验证我们的结论，我们设计了一个同时表达4个sgRNAs的CRISPR/Cas9载体，同时敲除SlARF6A、SlARF8A、SlARF8B和SlARF24基因。在转基因后代中成功得到了具有表型恢复的突变体植株CR4-3和CR4-4，其叶片表现为复叶。并分析了这两棵植株的基因型，结果表明，T3位点（SlARF6A）序列没有变化，T1位点（SlARF8B）、T2位点（SlARF8A）和T4位点（SlARF24）均出现了不同程度碱基的插入和缺失，结果表明，CR4-3和CR4-4植株同时敲除了SlARF8A、SlARF8B和SlARF24基因，为3突材料，可以使entire突变体出现一定程度的表型恢复。 5、CR4-3和CR4-4植株不仅叶形转变为一定程度的复叶，而且果实表现为单性结实率显著增加。IAA含量测定的结果表明，CR4-3和CR4-4植株叶片中的IAA含量与受体entire突变体叶片中的IAA含量相比，显著增加，呈极显著差异水平，结果表明，CR4-3和CR4-4植株叶片功能的恢复受到了生长素的调控。 6、酵母单杂交和双荧光素酶测定试验结果表明，SlARF6A和SlARF24可以特异性的与SlPIN1的启动子结合。我们猜测候选SlARFs蛋白可能通过调控SlPIN1基因的表达，进而调控叶片发育。
NETL