摘要
甜瓜(CucumismeloL.)是一种重要的园艺作物。我国甜瓜总产量占世界总产量的一半以上，并且消费市场大，消费需求多样化。甜瓜果实品质在很大程度上取决于果实内所含糖的种类和含量。细胞中糖主要积累在占细胞体积的70-80%的液泡中，而液泡中高浓度的糖含量依赖于液泡膜上糖转运蛋白的跨膜运输。研究甜瓜果实内糖积累的分子机制，不仅可以解析甜瓜果实糖积累的关键因素，而且能为甜瓜品质的遗传改良提供理论依据，具有重要的理论和现实意义。目前，在一些植物中对糖转运蛋白TST的研究表明它在液泡糖积累中发挥着重要作用，然而对于甜瓜液泡膜定位的糖转运蛋白TST尚无报道。本试验利用甜瓜基因组序列筛选液泡膜定位的甜瓜糖转运蛋白TST家族基因，通过RT-PCR、qRT-PCR研究它们在甜瓜果实不同发育时期的表达特性，并分析其表达与果实糖积累的关系；利用农杆菌介导瞬时表达方法对CmTSTs在本氏烟草和甜瓜中的亚细胞定位进行研究；利用草莓瞬时转化体系将CmTST1导入到草莓中，研究CmTST1的功能。试验结果如下： 1.通过与AtTST基因序列同源比对分析发现甜瓜中存在3个TST基因,分别名为CmTST1、CmTST2、CmTST3；通过进化树和线性分析发现这三个基因与拟南芥及葡萄中的TST具有较高的同源性；氨基酸序列亲疏水性分析表明CmTSTs与其它已知的TST一样具有12个跨膜结构以及一个超大的中央胞质环。上述分析结果表明CmTSTs是糖转运蛋白。 2.利用GC气相色谱技术测定甜瓜（品种为伊丽莎白）果实不同发育时期糖含量，发现葡萄糖和果糖的变化趋势一致，果实发育前期逐渐增加，28DAA达到峰值，之后缓慢下降。蔗糖的积累存在明显拐点，蔗糖含量在20DAA之前未检测到积累，20DAA之后显著上升，最终含量达到80mg/gFW以上。 3.以“伊丽莎白”甜瓜果实为材料，分析CmTST1、CmTST2、CmTST3在果实不同时期的表达量。RT-PCR和qRT-PCR分析结果都表明CmTST1在果实整个发育过程中都有较高表达，CmTST2主要在果实发育早期表达，而CmTST3在整个果实发育过程中都没有明显表达，因此推测只有CmTST1可能参与甜瓜果实后期糖分的积累。 4.扩增甜瓜CmTST1、CmTST2开放阅读框（去掉终止密码子）并分别构建到pH7LIC5.0-ccdBrc-N-eGFP载体上，获得eGFP-CmTST1、eGFP-CmTST2融合表达载体，进行亚细胞定位。结果显示，CmTST1和CmTST2都定位在液泡膜上。 5.利用双酶切的方法，将CmTST1构建到PBI121表达载体当中，获得35S-CmTST1过表达载体，再利用农杆菌将其注射到草莓果实中。GC气相色谱测糖结果表明，在草莓中过表达CmTST1后，果实中蔗糖和总糖的含量明显高于对照。 综上结果表明，CmTST1是甜瓜果实中定位于液泡膜上的糖转运蛋白，该蛋白在甜瓜果实糖分积累过程中起到重要作用。
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