摘要
葡萄糖转运蛋白4（GLUT4）是在骨骼肌，脂肪组织等胰岛素敏感性组织中调节葡萄糖稳态的重要蛋白，在静息状态时GLUT4储存在细胞内的囊泡中，而胰岛素刺激或AMPK等上游靶点的激活能够促进GLUT4从细胞内囊泡转移至细胞膜上。GLUT4的表达量下降或者转膜障碍会破坏细胞糖代谢稳态，造成胞外的葡萄糖无法摄取进入胞内并表现为机体胰岛素作用减弱和胰岛素抵抗。促进胰岛素敏感性组织中GLUT4的表达或者刺激细胞中GLUT4的转位上膜能够提高机体组织和细胞对葡萄糖的吸收，改善组织胰岛素抵抗。天然产物具有安全、毒副作用小、疗效确切等特点，因此从天然产物中寻找促进GLUT4表达或者转膜并进一步改善全身性糖脂代谢紊乱的潜在药物是目前研究的热点。课题组前期建立了基于大鼠骨骼肌L6细胞的GLUT4荧光标记药物筛选结合葡萄糖摄取以及westernblot技术的活性筛选体系。经过前期的体外活性筛选，课题组发现黄牛茶中分离得到的化合物海棠果醇（CNPL）、赶山鞭的酚类富集物（HA-PRE）、苦豆子的黄酮富集物（SA-FRE）具有显著地促进L6细胞GLUT4转膜或表达的活性。本课题研究了CNPL和HA-PRE体内外抗糖尿病活性和具体的活性机制，并且研究了SA-FRE的体内降血糖活性和初步的作用机制。 在体外活性评价实验中，CNPL能够促进L6细胞中GLUT4的转膜和表达，但是AMPK抑制剂CompoundC能够抑制CNPL诱导的GLUT4转膜，而Wortmannin（PI3K抑制剂）及G?6983（PKC抑制剂）没有表现出明显的抑制作用。上述结果表明CNPL通过促进AMPKα的磷酸化刺激GLUT4的转膜和表达，促进了L6细胞的葡萄糖摄取。体内实验结果表明，CNPL灌胃给药显著改善KK-Ay糖尿病小鼠的高血糖、受损的口服糖耐量、高胰岛素血症、肥胖和高脂血症。动物组织病理学切片结果显示，CNPL可以明显改善KK-Ay小鼠的肝脏脂肪化病变、胰岛代偿性肥大和脂肪细胞肥大的状况。Westernblot检测结果显示，CNPL给药显著促进了KK-Ay小鼠胰岛素靶组织中GLUT4和p-AMPKα的表达，表明CNPL在小鼠体内通过促进AMPKα磷酸化改善小鼠的胰岛素抵抗，调控糖脂代谢。CNPL也显著提升KK-Ay小鼠脂肪组织和肝脏组织的p-ACC表达，抑制了PPARγ的表达。这表明，CNPL在小鼠体内通过调控p-ACC和PPARγ的表达改善小鼠脂质代谢。 HA-PRE是从东北地区的植物赶山鞭中分离纯化得到的酚类化合物富集物。经过体外活性筛选发现，HA-PRE提高了L6细胞中GLUT4的表达量，促进L6细胞的葡萄糖摄取。体外作用机制研究表明，由HA-PRE给药所引起的L6细胞GLUT4表达量升高与GLUT4上游Akt和AMPK信号通路的激活有关，同时HA-PRE给药也促进了L6细胞GSK3β的磷酸化。体内实验结果表明，HA-PRE能够显著改善KK-Ay糖尿病小鼠的胰岛素抵抗和糖脂代谢紊乱等状况，促进肝糖原和肌糖原的合成。动物组织切片结果显示，HA-PRE灌胃给药可以改善KK-Ay小鼠的肝脏脂肪化病变、脂肪细胞肥大和胰腺代偿性肥大的状况。Westernblot实验结果显示，HA-PRE灌胃4周，显著促进了糖尿病小鼠胰岛素敏感性组织中GLUT4、p-AMPKα、p-Akt和p-GSK3β的表达。体外调控机制研究表明，AMPK通路抑制剂CompoundC能够部分抑制HA-PRE引起的AMPKα、Akt和GSK3β的磷酸化，Akt通路抑制剂wortmannin只能抑制HA-PRE所诱导的GSK3β和Akt的磷酸化，却没有表现出抑制AMPKα磷酸化的作用，这表明HA-PRE所引起的AMPKα的活化是调控Akt和GSK3β磷酸化的重要上游靶点，Akt的活化在HA-PRE诱导的经AMPKα活化所引起的抑制GSK3β的去磷酸化的活性中起到部分作用。 本课题还研究了苦豆子的黄酮富集部位（SA-FRE）的体内抗糖尿病活性。课题组前期的研究表明，SA-FRE在体外显示出能够通过激活PKC通路促进L6细胞GLUT4转膜和表达的活性。体内实验结果表明SA-FRE改善了高脂饲料联合STZ诱导的T2DM小鼠的高血糖、胰岛素抵抗、脂质代谢紊乱、脂肪肝和脂肪细胞肥大等状况。在体内活性机制研究方面，SA-FRE通过激活PKC信号通路促进小鼠骨骼肌和脂肪组织中GLUT4的表达，进而改善了小鼠的糖代谢紊乱。 本课题的研究结果表明，CNPL和HA-PRE在体外通过不同的活性机制促进L6细胞GLUT4表达或者转膜，CNPL或者HA-PRE能够改善KK-Ay糖尿病小鼠的糖脂代谢紊乱和胰岛素抵抗。SA-FRE的体内实验研究结果表明，口服灌胃给药SA-FRE能够显著改善高脂饲料饲养联合STZ注射造模小鼠的糖尿病症状。这说明基于GLUT4靶点体外活性筛选得到的活性组分或化合物能够在体内发挥显著的降糖活性，为发现潜在的新颖抗糖尿病药物提供了新的方案。
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