摘要
急性胰腺炎（acutepancreatitis，AP）是指由多种病因导致胰酶在胰腺内被激活后引起胰腺组织自身消化、水肿、出血甚至坏死的疾病。研究发现，约20%AP患者会进展为重症急性胰腺炎（severeacutepancreatitis，SAP）。在SAP病程中，由于局部或全身并发症的发生以及侵入性干预治疗引起的死亡风险高达30%，其中持续存在的器官衰竭是SAP严重程度的主要决定因素。业已证实，肠道容易受到炎症影响且与疾病的进展密切相关，严重的肠道损伤容易引起“二次打击”导致SAP病情加剧，因此控制SAP相关性肠损伤可能是有效治疗SAP的关键目标。 鸟苷酸环化酶C（guanylatecyclaseC，GC-C）是位于肠道上皮细胞胞膜上的跨膜受体，受内源性配体激活后引起细胞内环磷酸鸟苷（cyclicguanosincmonophosphate，cGMP）升高进而发挥生物学效应。GC-C因在调节水电解质平衡、维持肠屏障完整、控制炎症、缓解腹痛及调节肠道微生态等方面具有重要作用，近来被视为肠道疾病的潜在治疗靶点。GC-C激动剂Linaclotide是由氨基酸合成的内源性配体类似物，具有高亲和力、弱化PH依赖性和局部作用于肠道的特点，在消化系统疾病治疗中取得了众多进展。目前，对于GC-C在SAP相关性肠损伤中的变化规律和作用机制，以及Linaclotide是否对SAP相关性肠损伤有缓解作用尚不清楚，缺乏相关研究。基于此，本课题拟观察GC-C在SAP相关性肠损伤中的变化规律和作用，并探究通过Linaclotide激活GC-C是否可以有效缓解SAP相关性肠损伤的严重程度，试图为探索SAP治疗新靶点提供理论基础。 第一部分：GC-C在SAP相关性肠损伤中变化规律和发挥作用的实验研究 目的：探讨GC-C在SAP相关性肠损伤中的变化规律和作用 方法：36只雄性成年SD大鼠用随机数字表法分为假手术组（n=18，SO组，开腹后仅翻动胰腺数次后关腹）和重症急性胰腺炎组（n=18，SAP组，开腹后经胰胆管逆行微量缓慢泵入5%牛磺胆酸钠（0.1mL/100g）制备SAP模型）。各组根据用药时间再次随机分为12h组、24h组和48h组，每组6只。于建模后12h、24h、48h分批处死大鼠收集血清、胰腺和结肠组织。以HE染色评估胰腺与结肠病理改变；ELISA法测定血清中二胺氧化酶（DAO）、D-乳酸（D-Lac）、TNF-α和淀粉酶（AMY）浓度；通过RT-qPCR、免疫蛋白印迹法和免疫组织化学染色法检测结肠组织中GC-C和紧密连接蛋白Claudin-1的表达，选取GC-C表达最低的时间点作为肠损伤最严重的大概时间点，即作为干预时间点进行后续实验。 结果：GC-C在SAP组结肠中表达显著降低，于建模后12h表达最低（P＜0.05），但随时间推移GC-C逐渐升高。结肠中Claudin-1表现出相似的趋势。与SO组相比，SAP组结肠表现为不同程度的粘膜不连续、间质水肿及炎性细胞浸润，病理学评分升高（P＜0.05）；血清AMY、DAO、D-Lac和TNF-α均显著升高（P＜0.05）；结肠中GC-C和Claudin-1表达下降。 结论：GC-C在SAP相关性肠损伤中呈现出先下降后升高的趋势，于SAP-12h组表达最低，遂以建模后12h作为后续干预时间点。肠道Claudin-1的表达与GC-C具有相似性，提示GC-C可能通过影响紧密连接蛋白的表达来维持肠屏障功能的完整性。 第二部分：Linaclotide干预SAP相关性肠损伤效果最佳次数的实验研究 目的：明确Linaclotide给药后效果最佳次数 方法：30只雄性成年SD大鼠随机分为SO组、SAP组和Linaclotide组，根据Linaclotide半衰期为6h，再次分为干预1次组（L1）、干预2次组（L2）和干预3次组（L3），每组6只大鼠。SO组及SAP组造模方法同前；Linaclotide组在诱导SAP后立即向胃内灌注Linaclotide水溶液（10μg/kg/d），其中L1组于造模后立即灌胃1次，L2组于造模后0h、6h分别灌胃1次，L3组于造模后0h、4h、8h分别灌胃1次。于建模后12h处死大鼠收集结肠组织,通过RT-qPCR和免疫蛋白印迹法检测结肠中GC-C表达。 结果：GC-C在SAP组中表达显著低于SO组和Linaclotide组，与SAP组相比，Linaclotide组中GC-C表达升高，于L2组中表达显著高于L1和L3组（P＜0.05）。 结论：GC-C于L2组中表达升高最显著，表明Linaclotide干预SAP大鼠相关性肠损伤效果最佳的次数为2次。 第三部分：Linaclotide缓解SAP相关性肠损伤的实验研究 目的：探究Linaclotide缓解SAP相关性肠损伤炎症反应与组织损伤的疗效性评估及机制研究 方法：18只雄性成年SD大鼠随机分为SO组、SAP组和Linaclotide组，每组6只大鼠。各组大鼠造模方法同前。于建模后12h处死大鼠收集血清和结肠组织，HE染色法评估结肠病理；ELISA法测定血清中DAO、D-Lac、TNF-α和内毒素浓度；通过RT-qPCR检测结肠组织中TNF-α和GC-CmRNA的表达，采用免疫蛋白印迹法、免疫组织化学染色法和透射电镜检测结肠组织中GC-C、紧密连接蛋白Claudin-1和JAM-A的表达。 结果：与SO组相比，SAP组和Linaclotide组中结肠组织均表现出不同程度的损伤，病理学评分均升高（P＜0.05）；血清DAO、D-Lac、TNF-α和内毒素均显著升高（P＜0.05）；结肠中TNF-α表达升高而GC-C、Claudin-1、JAM-A表达下降（P＜0.05）。与SAP组相比，Linaclotide组结肠病理评分降低（P＜0.05），血清中上述各因子水平降低（P＜0.05），结肠组织中GC-C、Claudin-1、JAM-A表达水平升高（P＜0.05），TNF-α表达降低（P＜0.05）。 结论：GC-C激动剂Linaclotide不但抑制了全身炎症反应，还降低了SAP大鼠结肠损伤因子和促炎因子的水平，上调了结肠组织中GC-C、Claudin-1、JAM-A的表达量，改善了肠屏障功能，进而缓解了SAP相关性肠损伤。
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