摘要
糖尿病是一种胰岛素抵抗时诱发的代谢性疾病。我国有超过1.14亿糖尿病患者，是世界上糖尿病患者最多的国家，对家庭和社会带来沉重负担。有临床研究证明魔芋葡甘聚糖（Konjacglucomannan，KGM）具有改善糖尿病的作用，但KGM分子量范围较大，从几万到几十万Da，甚至达到两百万Da。目前对不同分子量KGM的改善糖尿病作用大小及其作用机制的研究甚少。因此，本论文在制备和分析不同分子量KGMs理化特征的基础上，系统地研究不同分子量KGMs对淀粉消化、粪菌发酵和肠道菌群代谢物质的影响，进而在2型糖尿病（Type2diabetesmellitus，T2DM）大鼠中探究不同分子量KGMs改善糖尿病的作用机制。主要的研究结果如下： （1）明确了不同分子量KGMs结构特征。选取高分子量魔芋葡甘聚糖KGM-H（1129.5kDa）和中分子量魔芋葡甘聚糖KGM-M1（757.1kDa），并采用5kGy和50kGy的辐照降解KGM-M1分别获得KGM-M2（252.7kDa）和KGM-L（87.3kDa）。结果显示不同分子量KGMs的葡萄糖和甘露糖摩尔比例接近，并且分子基团、晶体结构、糖残基构成和连接方式基本一致。在一定分子量范围内，随着分子量的降低，KGM黏度降低。 （2）比较分析了不同分子量KGMs体内外改善糖尿病的作用。体外淀粉消化结果表明，在一定分子量范围内，不同分子量KGMs抑制淀粉消化的作用随着分子量的减小而降低。经T2DM大鼠粪菌发酵后，不同分子量KGMs发酵液的pH均明显降低，还原糖均显著升高。此外，不同分子量KGMs均能显著增加T2DM大鼠粪菌发酵液中短链脂肪酸（Shortchainfattyacid,SCFA）含量（P＜0.01），其中KGM-M1和KGM-M2促进SCFA生成的作用更强。进一步在T2DM大鼠模型中发现KGM-M1和KGM-M2降糖作用优于KGM-H和KGM-L，表现在更显著降低T2DM大鼠空腹血糖（Fastingblood-glucose，FBG），减小胰岛素抵抗指数以及血糖曲线下面积AUC值，同时促进胰高血糖素样肽-1（Glucagon-likepeptide-1，GLP-1）分泌。KGM-M1和KGM-M2相比KGM-H和KGM-L更有利于缓解T2DM大鼠胰岛素抵抗和糖耐量受损，改善血糖代谢。此外，KGM-M1和KGM-M2在降低甘油三酯、肿瘤坏死因子-α和丙二醛水平、提高超氧化物歧化酶水平方面也具有较高的活性。组织病理切片结果显示KGM-M1和KGM-M2对T2DM大鼠的胰岛损伤和萎缩、结肠固有肌层损伤和肠绒毛萎缩的修复作用更强。综上表明KGM-M1和KGM-M2的改善糖尿病作用更强，提示不同分子量KGMs改善糖尿病作用可能主要与其在粪菌发酵中产生的SCFA有关。 （3）探究了不同分子量KGMs调节T2DM大鼠肠道菌群紊乱和代谢障碍的作用。经16SrRNA分析，发现经KGM-M1和KGM-M2干预后能够更加明显地增加T2DM大鼠肠道菌群的多样性以及Bacteroidetes/Firmicutes的比值（P＜0.01）。其次，不同分子量KGMs均能显著降低T2DM大鼠的Romboutsia和Klebsiella的丰度（P＜0.05）。并且，KGM-M1和KGM-M2更有利于促进T2DM大鼠Muribaculacea生长。血清代谢组学结果表明KGM-M1和KGM-M2对6种糖尿病相关标志物调节作用更强。通过代谢通路富集分析，发现胆汁酸生物合成代谢通路差异最为显著。 （4）发现KGM-L和KGM-M1可能通过调节T2DM大鼠肠道菌群，介导SCFA受体和胆汁酸合成通路基因表达进而发挥改善糖尿病作用。为了进一步研究不同分子量KGMs改善糖尿病作用差异的分子机制，选取综合改善糖尿病作用差异较大的KGM-L和KGM-M1进行深入研究。结果显示，KGM-M1比KGM-L的降低T2DM大鼠糖脂水平能力、减轻炎症和修复结肠屏障的作用更强，并明显上调紧密连接蛋白ZO-1和Occludin的表达，促进粪便SCFA生成以及GPCRs的基因表达。此外，KGM-M1更有利于促进肝脏FXR和SHP的基因表达，并抑制CYP7A1和CYP27A1的基因表达。16SrRNA结果显示，KGM-M1相比KGM-L能够更明显促进肠道菌群多样性以及显著增加Muribaculaceae、Ruminococcus和Lachnoclostridium菌属的丰度。 （5）验证了肠道菌群在KGM-L和KGM-M1改善糖尿病作用和机制中的重要性。经抗生素干预后，KGM-L和KGM-M1对T2DM大鼠的降糖降脂、抗炎、修复结肠完整性以及促进ZO-1和Occludin蛋白表达的作用减弱。并且其调节肠道菌群，促进SCFA生成和GPCRs基因表达以及调节胆汁酸合成通路基因表达的作用消除。肠道菌群移植（Fecalmicrobiotatranslocation，FMT）后，FMT-KGM-L和FMT-KGM-M1相比FMT-T2DM组的FBG分别降低4.0%和10.4%；胰岛素抵抗指数值分别降低6.7%和23.1%；AUC值分别降低13.3%和21.2%。此外，FMT-KGM-M1相比FMT-KGM-L还具有较强的降低血脂水平、抗炎和修复结肠屏障功能。与FMT-T2DM相比，FMT-KGM-L组的CYP27A1和CYP7A1基因表达下调，CYP8B1、FXR和SHP的基因表达上调。FMT-KGM-M1组的SHP基因表达显著上调（P＜0.01）、CYP27A1基因表达显著减少（P＜0.05），FXR和CYP8B1基因表达明显上调，CYP7A1基因表达明显下调。16SrRNA分析结果发现FMT-KGM-M1更有利于产SCFA菌属的生长，并且能够抑制糖脂代谢紊乱相关的有害菌增殖。
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