摘要
表面活性素（Surfactin）是由芽孢杆菌属（Bacillus）通过一种独特的非核糖体多肽途径合成的环状脂肽类化合物。表面活性素具有表面活性强、环境兼容性强、毒性低以及生物降解性好等优势，在食品安全、日用品、化妆品、饲料工业、医学应用、环境科学、石油工业等方面具有巨大的应用前景。表面活性素尚未实现工业化生产，主要存在的问题：产量低和成本高。因此，本研究以解决问题为导向，着手提高其产量。本研究先通过诱变选育以及航天选育，筛选出表面活性素高产菌；之后对诱变后的菌株进行组学分析；优化其发酵条件；并研究其提取纯化后的表面活性素的生物学活性。主要研究内容及结果如下： 1.本研究获得了一株产表面活性素的枯草芽孢杆菌原始菌株，在此基础上通过紫外、化学和航天诱变，将血平板、CPC-BTB高通量和高效液相色谱法筛选相结合，筛选出一株稳定遗传的复合诱变菌株，枯草芽孢杆菌FHYB201030。其表面活性素产量比原始菌株提高了16.8倍，产量基本稳定在0.353mg/mL。营养琼脂平板的诱变菌株菌落表面粗糙、隆起，有皱褶，菌苔存在较多的粘性物质，挑取拉丝。与原始菌株相比，诱变株FHYB201030的生长速度较慢，延滞期长，但生长周期缩短。 2.对原始菌株进行全基因组测序，以此为参照基因组序列，对复合诱变菌株枯草芽孢杆菌FHYB201030全基因组重测序，探究复合诱变对该菌株基因层面上的影响。本研究使用NanoporePromethION平台和IlluminaNovaSeqPE150对原始菌株的全基因组进行测序。结果显示，原始菌株全基因组由一条5209013bp的完整环状染色体和一条299348bp的完整环状质粒组成，其GC含量分别为35.53％和33.17％。位于CDS（蛋白质编码区域），非同义突变的SNP有61个，同义突变的有254个，未引起移码的InDel有2个，引起移码的有6个。而位于基因间区的SNP有135个，InDel有4个。为探讨表面活性素相关合成基因，以及通过基因手段构建表面活性素高产菌株等研究及应用打下基础。 3.以CPC-BTB数值为评价指标，以枯草芽孢杆菌FHYB201030为试验菌株，通过单因素试验和Plackett-Burman试验，筛选出显著影响表面活性素产量的因素；利用最陡爬坡设计逼近产表面活性素最大区域，保证结果的有效性；进行Box-Behnken因子设计，优化产表面活性素的发酵条件。优化后获得的最佳发酵条件为：温度40℃、转速200r/min、接种量7%、装液量30%；培养基配方：乳糖20g/L、酪蛋白10g/L、牛肉膏3g/L、蛋白胨10g/L、NaCl5g/L、Mn2+0.5mmol/L、乳酸钠1mmol/L、Glu2g/L，初始pH7.5；培养时间72h。在该发酵条件下，实测CPC-BTB值为0.3195，与预测值的0.31714接近，最终表面活性素的产量基本维持在0.475mg/mL。 4.枯草芽孢杆菌FHYB201030发酵后的处理包括：离心取上清，酸沉淀，冷冻干燥，乙醇萃取等以获得表面活性素，并研究其活性。结果表明，与原始菌株相比，复合诱变菌株的发酵产物的排油性提高了88.38%，乳化性能提高11.79%，发泡性能提高66.67%。表面活性素提取物及其发酵液对细菌（大肠杆菌、沙门氏菌以及金黄色葡萄球菌）和真菌（黑曲霉、根霉、红酵母）的抑制效果显著，并且对指示菌的生长有很明显的杀菌作用。 5.将提取的表面活性素进行体外的抗病毒试验。首先利用CCK-8法测定表面活性素对Vero细胞和Marc-145细胞的影响，以此为参考，将其进行稀释成不同浓度进行后续的抗病毒试验。不同安全浓度的表面活性素通过三种方式（先加药后加病毒、药和病毒同时加入，以及先加病毒再加药）以评估对两种囊膜病毒，猪流行性腹泻病毒（PEDV）和猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒（PRRSV）的抑制作用。结果表明，对病毒的处理方式不同，抑制效果存在差异，表面活性素直接灭活PEDV和PRRSV的效果显著，但是较低浓度的（0.48和1.95μg/mL）表面活性素却不能有效地杀灭PRRSV。另外，表面活性素基本上无法阻止PEDV吸附Vero细胞并复制，而高浓度（62.5μg/mL）的表面活性素对PRRSV的吸附和复制有一定抑制作用。 结论：本研究筛选的高产表面活性素的复合诱变菌株发酵过程产生的表面活性素产物活性强，可以有效抗细菌、抗真菌和对囊膜病毒具有显著的抑杀作用。本结果为未来研发相关表面活性素产品提供理论基础和技术支撑，为表面活性素的商业化生产提供可能。
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