摘要
在现代化的猪生产体系中，通过人工授精技术将优秀种公猪的遗传性能传递到商品群，可最大限度发挥优良动物的遗传潜能，因此研究公猪精液质量具有非常重要的意义。在实际生产中精液质量往往只检测公猪的采精量、精子活力、密度、畸形率等感官指标，它们不能完全反映公猪精液的受精能力和对繁殖性能的影响。研究表明，精浆对精子质量具有重要作用，尤其精浆中一些蛋白质可调控精子的受精能力，研究这些蛋白质有利于找到更多提高公猪精液质量的方法或者鉴别出不同繁殖力的公猪。近年来，体液中的胞外囊泡（Extracellularvesicles,EVs）受到了研究者的特别关注，它被认为广泛存在于各种体液中，而且调控着细胞间的相互作用。许多物种的精浆中均被证实含有EVs，这些EVs可以影响精子的功能，而且还可作为雄性繁殖力或是不孕不育相关疾病的标志。不过，目前对公猪精液中的EVs的研究还比较有限。本论文旨在分离出符合最新国际EVs鉴定标准的猪精浆胞外囊泡（Seminalplasmaextracellularvesicles,SP-EVs），研究其生理功能，并进一步通过DIA（Dataindependentacquisition）蛋白组学技术，寻找猪SP-EVs中影响精子生理功能的关键蛋白质分子，同时验证该蛋白的作用是否与SP-EVs一致，最后证明该蛋白是否由猪SP-EVs转移到精子发挥调控功能。本论文获得主要结果如下： 1.本论文对比了密度梯度超速离心法、沉淀法和亲和色谱法分离猪精浆胞外囊泡的效果，其中利用透射电子显微镜和检测胞外囊泡中RNA质量发现密度梯度超速离心法和亲和色谱法可分离到呈明显的杯状囊泡样结构且完整性良好的胞外囊泡，而沉淀法分离到的胞外囊泡则没有看到明显的杯状囊泡样结构；进一步通过粒径分析证明密度梯度超速离心法分离到的猪SP-EVs大部分颗粒尺寸在50至200nm之间；通过Westernblots证明SP-EVs具有胞外囊泡的标志蛋白CD9和CD63，且不含有细胞蛋白Calnexin，说明密度梯度超速离心法可有效分离纯化猪SP-EVs； 2.用300μg/mL和600μg/mL蛋白浓度的猪SP-EVs处理精子后可抑制猪精子获能、顶体反应和精子的体外受精能力，但不影响受精后胚胎发育能力； 3.通过DIA蛋白质组学筛选出了SP-EVs中影响猪精子功能的主效蛋白因子ezrin，并用PRM（Parallelreactionmonitoring）技术验证了该蛋白在用SP-EVs处理精子后的差异表达水平；进一步发现在猪精子中用30μM浓度的抑制剂抑制该蛋白，可促进猪精子获能、顶体反应和体外受精能力，而且可显著促进胚胎发育能力，该结果反向验证了猪精浆胞外囊泡的生理功能，同时也是首次在猪精子中关于ezrin蛋白功能的研究； 4.通过免疫组化实验证明ezrin蛋白在睾丸、附睾、前列腺和精囊腺等部位大量表达，而在尿道球腺表达较少，并证实猪精浆胞外囊泡可将ezrin蛋白转移到猪精子中，抑制猪精子ezrin蛋白可抑制AMPK通路。 综上所述，本论文研究了密度梯度超速离心法可有效分离猪SP-EVs，并证明了猪SP-EVs可以抑制猪精子获能、顶体反应和体外受精能力；同时通过蛋白质组学筛选出了猪SP-EVs影响精子功能的一个主要蛋白ezrin，证实了ezrin蛋白是由猪精浆胞外囊泡转移到猪精子中发挥调控功能。
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