摘要
新城疫（Newcastledisease,ND）是由副黏病毒科的新城疫病毒（Newcastlediseasevirus,NDV）感染禽类后引起的一种急性、高度接触性传染病，长期威胁养禽业的发展。虽然近年来NDV的强毒株逐渐减少，但是持续被分离到的弱毒株以及时有暴发的ND疫情表明NDV仍将持续影响养禽业的健康发展。AGC丝氨酸/苏氨酸激酶（AGCserine/threoninekinases,AKT）和雷帕霉素的机制靶点蛋白（themechanistictargetofRapamycin,mTOR）构成的信号通路是机体进行正常生命活动的重要调控途径。病毒在感染过程中与宿主有着持续的相互作用，其中宿主的信号通路反应能够参与调控病毒复制的过程，同时病毒也会影响信号通路的变化，复杂的机制决定了病毒是否能够完成增殖。有大量研究表明，AKT/mTOR信号通路与病毒感染之间存在着密切联系，并且自噬在其中起到关键作用，但是该通路与NDV感染之间的研究较少，具体的机制仍不清楚。而已有研究证明，NDV能够诱导自噬且能够激活AKT。基于此，本论文从蛋白分子水平上解析了AKT/mTOR信号通路、自噬和NDV感染三者之间的关系。本论文主要包括以下内容： 1.NDV能够激活AKT/mTOR信号通路且利用该通路促进自身复制 本论文通过NDV强毒株GM株和紫外灭活的UV-GM株感染DF1和HeLa细胞，表明GM株能够激活AKT/mTOR信号通路，并且该通路的激活依赖于病毒复制。之后，本论文通过使用特异性抑制剂与激动剂进行了一系列试验，表明AKT和mTOR的特异性抑制剂能够显著抑制NDV在细胞中的复制，而AKT的激动剂则能促进NDV的复制。本论文还构建了AKT持续激活的细胞模型，且该模型能够促进NDV在细胞中的复制。本论文利用siRNA有效干扰了mTOR的两个复合体mTORC1和mTORC2中的关键配体mTOR相关的调节蛋白（regulatoryproteinassociatedwithmTOR,RAPTOR）和mTOR对雷帕霉素不敏感伴侣（rapamycininsensitivecompanionofmTOR,RICTOR）蛋白的合成，并通过GM株感染试验发现NDV的复制需要mTOR两个复合体的参与。以上结果表明mTORC2/AKT/mTORC1信号通路在NDV的复制过程中发挥着重要作用，并且mTORC1和mTORC2蛋白对于NDV的复制是必需的。 2.NDV诱导的细胞自噬在感染中前期促进病毒复制，感染后期抑制病毒复制 本论文接下来解析了GM株是否诱导自噬，以及自噬对病毒复制的影响。通过透射电镜观察自噬体结构、激光共聚焦显微镜观察自噬小体、Westernblot检测自噬相关蛋白等技术手段，本论文证明了GM株能够诱导DF1细胞产生自噬。为了检测自噬对NDV复制的影响，本论文使用自噬抑制剂3-甲基腺苷和氯喹抑制自噬，发现GM株在感染中前期（12h内）的复制水平会因为自噬抑制而降低，但在感染后期（12h后）反而增加，表明NDV诱导的细胞自噬在病毒感染的不同时间段对病毒复制的影响不同，感染中前期NDV利用自噬促进自身复制，感染后期自噬抑制病毒复制。 3.NDV通过AKT/mTOR信号通路调控自噬 自噬与AKT/mTOR信号通路之间关系密切，本论文通过抑制AKT/mTOR信号通路的活性，检测感染NDV强毒株GM株后自噬相关蛋白的表达情况。结果表明，GM株感染DF1后，AKT/mTOR信号通路下游的UNC-51样-激酶1（UNC-51-like-kinase1,ULK1）的Ser757位点磷酸化会随着感染时间的增加而增加，该位点的磷酸化会引起自噬水平的降低。当AKT/mTOR信号通路的活性受到抑制后，其下游ULK1的Ser757位点磷酸化水平降低，从而促进自噬。同时，随着自噬水平的增加，GM株的复制水平在感染前期得到促进，但在感染后期受到抑制，与抑制自噬时的现象相反，进一步证明了自噬对NDV复制的作用，也表明NDV能够通过AKT/mTOR信号通路调控自噬，促进自身的复制。 4.NDV的病毒蛋白参与调控AKT/mTOR信号通路 本论文通过转染NDV的各病毒蛋白真核质粒至DF1和HeLa细胞，发现NDV的NP蛋白能够激活AKT的Ser473位点，且NP质粒转染剂量越大，激活效果越明显，但是mTOR并不被NP磷酸化。通过siRICTOR敲低RICTOR蛋白的表达后，发现NP蛋白对AKTSer473位点的激活程度降低，表明NP蛋白通过mTORC2激活AKT。后续进行的免疫共沉淀和间接免疫荧光试验结果表明，NP蛋白与RICTOR蛋白存在互作。以上研究结果初步证明，NDV结构蛋白NP能够参与调控AKT/mTOR信号通路。 本论文根据国内外最新研究进展，在前期研究的基础上，主要发现了AKT/mTOR信号通路对NDV强毒株GM株的复制有着重要促进作用；GM株能诱导自噬，且自噬在感染前期促进病毒复制，在感染后期抑制病毒复制；GM株通过激活AKT/mTOR信号通路在感染后期抑制了自噬的水平，从而降低了自噬对病毒复制的抑制作用；GM株的NP蛋白能够通过mTORC2激活AKTSer473位点，同时NP蛋白能够与RICTOR蛋白互作。本论文进一步拓展丰富了NDV感染致病的分子机制，并为其他副黏病毒科成员的研究提供了新的科学理论与思路。
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