摘要
单倍体是指只具有配子染色体组的个体，基因型处于杂合状态的个体可以通过配子体诱导产生多种基因重组的单倍体。杂交育种的关键在于选育优良的自交系，传统育种需要通过7-9个世代才能获得稳定遗传的自交系材料，单倍体育种只需两代就可获得高纯度的双单倍体系（DoubledHaploid，DH），能够显著提高育种效率。Ravi等在2010年首次证明拟南芥着丝粒特异性组蛋白CENH3互补替换系（GFP-tailswap-CENH3）单倍体诱导频率高达25%-45%，随后CENH3HFD结构域突变以及致死突变cenh3杂合子均被证明具有单倍体诱导功能。水稻作为重要的粮食作物，其单倍体育种进展缓慢，由于CENH3蛋白在真核生物中的高度保守性，因此在水稻中开发以OsCENH3为基础的单倍体诱导系具有重要的研究价值。本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对粳稻日本晴OsCENH3的编码区、启动子区进行编辑，并结合融合基因互补技术对日本晴OsCENH3同时进行敲除和互补，创制出多种类型的水稻cenh3突变体，并探讨不同类型的cenh3突变介导水稻高效单倍体诱导的可能性。主要实验结果如下： （1）生物信息学分析表明水稻OsCENH3是高度保守的着丝粒特异性组蛋白基因。蛋白质结构预测结果显示OsCENH3蛋白具有保守的C-端组蛋白折叠结构域（HFD）和可变的N-端尾部结构域（tail）；序列比对结果表明，OsCENH3的组蛋白折叠结构域与同源家族的7个组蛋白H3高度相似，并在拟南芥、玉米、大麦等多种植物中高度保守；启动子元件预测结果表明，OsCENH3上游2kb序列中存在大量基础转录调控的顺式作用启动子元件，包括启动子核心作用元件TATA-box和CAAT-box等；芯片数据分析表明，OsCENH3主要集中在穗、种子、根尖和茎顶端分生组织等细胞分裂活跃的组织表达，且幼穗较成熟穗表达量高，花器官中雌蕊表达量较高。 （2）利用CRISPR/Cas9技术获得水稻OsCENH3编码区、启动子区及敲除互补的系列突变体。编码区区7个单靶敲除株系共获得456株转基因阳性植株，有54株在靶点处发生突变，tail结构域突变效率为41.56%，HFD结构域突变效率相对较低，最高为19.35%，在其自交后代中获得5种类型的tail结构域整码缺失突变体和1个HFD结构域6bp缺失的突变体，T0代未获得纯合突变，表明HFD结构域在水稻中的功能高度保守，其功能缺失对于水稻植株是致死的；启动子区两个双靶点敲除株系分别以15.15%和22.86%的突变效率获得43株靶点突变植株，均未获得大片段缺失突变体，在自交后代中分离出两个启动子核心作用元件缺失的纯合突变体；敲除互补共表达株系以33.33%的突变效率获得63株靶点突变植株，互补基因均成功插入基因组中，在其自交后代中分离出7种类型的突变体，包括仅互补融合基因、整码缺失、点替换突变体以及19bp缺失突变类型。表型调查发现，与日本晴野生型植株相比，cenh3突变体株型矮小、花期推迟，花器官发育受到影响，在开花结实期花粉育性下降，结实情况较差，在其自交后代中出现较多败育籽粒，表明cenh3突变对水稻植株生长发育产生了一定影响。 （3）水稻OsCENH3编码区及启动子区突变导致其表达量下调。编码区tail结构域的突变体与野生型植株相比，根尖表达量显著下降，HFD结构域6bp缺失突变体在各组织中的表达量均极显著下降，推测tail结构域氨基酸的截短对OsCENH3在植株有丝分裂过程中表达量的影响较大，HFD结构域的改变对植株有丝分裂和减数分裂过程中OsCENH3基因的表达量都产生影响；启动子区的两个突变体在各组织中表达量均有下降，在根尖和成熟穗中与野生型差异显著，表明启动子区的敲除导致OsCENH3表达量下调；敲除互补双突突变体中OsCENH3-GFP-tailswap融合基因在各组织中均有较高表达量，表明融合基因成功互补进入水稻基因组中并表达。 （4）获得7个具有单倍体诱导潜力的cenh3突变体。编码区突变体C1-4和C1-5，cenh3尾部结构域分别截短4个和12个氨基酸，敲除互补突变体C3-3N-端尾部截短1/4，编码区突变体C1-7HFD结构域缺失两个氨基酸（73V、74A），上述突变体与野生型相比长势较差、株高显著下降，根尖有丝分裂出现染色体异常现象，在其自交后代中出现大量败育籽粒，与已报道的诱导系突变类型和表型相符，具有单倍体诱导潜力。敲除互补突变体C3-6，仅翻译出27个正确氨基酸，导致HFD结构域的完全缺失，其纯合突变类型无法正常生长，种子完全败育，胚胎发育致死，与玉米中胚致死cenh3杂合子单倍体诱导系一致。启动子区的两个突变体C2-1和C2-2，植株生长发育受到影响，基因表达量下降可能导致着丝粒CENH3蛋白负载量减少，因此具有单倍体诱导潜力。
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