摘要
猪δ冠状病毒（Porcinedeltacoronavirus,PDCoV）又称猪D型冠状病毒为带有囊膜的正链单股RNA病毒，属于尼多目、冠状病毒科、δ冠状病毒属成员。猪感染后表现为采食量下降、呕吐、水样腹泻和脱水等临床症状，严重时会致死，可以感染各个年龄阶段的猪，尤其是肠道发育不全的新生仔猪。此外PDCoV、猪流行性腹泻病毒（Porcineepidemicdiarrheavirus,PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（Porcinetransmissiblegastroenteritis,TGEV）、猪急性腹泻病毒（Porcineacutediarrheasyndrome,SADS-CoV）和猪轮状病毒（Porcinerotavirus,PoRV）等猪病毒性腹泻病原体在临床上引发相似的症状，而且常常会出现混合感染的情况，所以很难对该病进行防控和检测。2012年在中国香港首次发现PDCoV，2014年在美国流行爆发，目前已遍及全世界，呈全球流行趋势。对生猪健康以及生猪养殖业造成了极大地威胁，有研究表明可能对人类的健康也会有潜在影响。 本试验根据PDCoV和PEDV保守区域设计引物并建立了一种双重逆转录重组酶介导的核酸扩增（Reversetranscription-recombinasepolymeraseamplification,RT-RPA）检测方法。从GenBank中下载多条序列并用MegAlign进行对比分析挑选保守序列，设计RPA引物进行双重RT-RPA试验对引物进行筛选，并对反应条件和体系进行优化，结果表明最佳反应条件为39.0℃，恒温扩增40min，引物比例1:1，建立的方法具有良好的特异性，最低检测值为100copies/μL，优于RT-PCR。对19份粪便样品和26份肠道样品共45份临床样品进行检测，其中PDCoV为阳性的样品4份，阳性率为8.89%（4/45），其中粪便样品2份（2/19），肠道样品2份（2/26）；PEDV为阳性的样品13份（13/45），阳性率为28.89%，其中粪便样品6份（6/19），肠道样品7份（7/26）；一份粪便样品中同时检测出PEDV和PDCoV。与RT-PCR检测方法阳性检出率一致，证明了该方法可用于现场检测，且效果较好，具有应用前景。 此外本文还构建了pET-32a-PDCoV-N重组表达载体，预测重组蛋白大小为61.6kDa，通过SDS-PAGE和Western-blot进行验证。确定了蛋白表达最佳诱导的条件，纯化诱导表达后的蛋白并对其进行浓度测定，每次将抗原蛋白与佐剂1:1稀释成0.3mg/mL共100μL，免疫BALB/c小鼠，确定小鼠内血清抗体效价到达1:10000后，将骨髓瘤细胞（SP2/0）和小鼠脾细胞进行细胞融合，间接ELISA方法对阳性杂交瘤细胞筛选。再通过有限稀释法获得可稳定分泌抗N蛋白抗体的阳性杂交瘤细胞2株，分别命名为#25和#73。对效价高的#73进行IFA试验和Western-blot试验检验，均可与PDCoV发生免疫反应，用其他常见猪腹泻病毒PEDV、TGEV、SADS-CoV和PoRV验证特异性，结果显示没有交叉反应，特异性良好。用PDCoV阳性猪作为临床样品，并对空肠做病理切片进行组织IFA试验，显示所制备的单抗效果好，能特异性的与病毒结合显色。 综上所述，本次研究建立了PEDV和PDCoV的双重RT-RPA检测方法，能够快速对这两种病毒进行鉴定；同时，本研究基于PDCoV的N基因序列构建蛋白表达载体表达重组N蛋白，并以此制备了特异性的单克隆抗体。本研究的成果可以为PDCoV的诊断研究和N蛋白的结构功能研究提供相关依据和物质基础。
NETL