摘要
犬白介素-6（Canineinterleukin-6，犬IL-6）是一种具有多种促炎作用的多效性细胞因子。其生物功能包括吞噬细胞分裂的诱导、补体的激活、疫苗免疫的增强。犬IL-6是由单核细胞、巨噬细胞、T淋巴细胞所分泌的某些非特异性发挥免疫调节以及在炎症反应中起作用的细胞因子。免疫动物血清或细胞中细胞因子水平是衡量疫苗免疫效果的重要指标之一。因此，建立犬IL-6的检测方法，对于评价疫苗的免疫效果具有重要意义。 为了原核表达IL-6蛋白，将IL-6基因与表达载体pET-32a（+）连接，构建表达IL-6蛋白的重组质粒pET-IL6。经菌液PCR、双酶切、测序鉴定正确后，将pET-IL6质粒转化到感受态细胞BL21中，以IPTG诱导表达。经考马斯亮兰染色分析，获得了大肠杆菌表达的IL-6蛋白，其分子量为38.28kDa。经对表达产物的上清和沉淀分析，IL-6蛋白以包涵体的形式存在。经洗涤、溶解、纯化，获得纯化的IL-6蛋白，将蛋白进行质谱鉴定，进一步确认IL-6蛋白的成功表达。 为了制备IL-6的单克隆抗体，以纯化的IL-6蛋白作为抗原与佐剂混合、乳化，三次免疫BALB/c小鼠。测定小鼠血清中抗IL-6的抗体效价，取效价较高小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合。经多次筛选，获得稳定分泌特异性单克隆抗体的细胞株。扩大培养融合细胞，再将杂交瘤细胞（1×106个/mL）注射到BALB/c小鼠腹腔，待小鼠腹部明显膨大时，抽出的腹水即为单克隆抗体。用间接ELISA方法测定其抗体效价为1∶1×106，再用间接免疫荧光和Western-blotting方法对单克隆抗体进行确证。 为了制备夹心ELISA所需的检测抗体，以纯化的IL-6蛋白作为免疫原，分别于第0d、第14d、第28d三次免疫新西兰大白兔。于最后一次免疫后第7d采血，测定血清中抗IL-6的效价。结果显示，抗体效价为1∶1×105。 为建立检测犬IL-6蛋白的夹心ELISA方法，以IL-6单克隆抗体作为捕获抗体包板，兔抗IL-6多克隆抗体作为检测抗体，羊抗兔酶标抗体作为二抗，并对夹心ELISA方法进行了优化。结果显示，捕获抗体浓度为48μg/mL、5％脱脂奶粉封闭1h、检测抗体1∶100稀释、二抗1：500稀释时，夹心ELISA方法结果最优，灵敏度为：1.17ng/mL～300ng/mL。 本研究成功表达犬IL-6蛋白，以该蛋白为免疫原，制备了IL-6的单克隆抗体。以该单克隆抗体为捕获抗体，建立了检测犬IL-6蛋白的双抗夹心ELISA方法。目前国内外对于人IL-6与其他动物IL-6研究较多，对于犬IL-6研究还较少。因此，建立犬IL-6检测方法，对于一些犬病的发病机制的研究和辅助性诊断有着非常重要的意义，该方法的建立为评价犬只的疫苗免疫效果奠定了技术基础。
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