目的: 牛大力是岭南地区常用药材，既可入药，又作药膳，使用十分普遍。牛大力以根入药，是多年生药材，在资源开发的过程中会产生大量废弃的茎叶，造成严重的资源浪费。对牛大力基原植物进行不同部位的生物化学研究，有助于更系统地了解其开发价值和潜力。根据报道，牛大力的活性成分包括:黄酮、异黄酮、多糖、氨基酸，但未见关于这些活性成分的生物合成及调控的相关研究。本文基于转录组和代谢组对牛大力黄酮类成分的合成与累积进行研究，以期阐明牛大力上述活性成分的生物合成及分布机制，为其资源综合开发利用提供基础资料。 方法: 通过液质联用技术解析牛大力根、茎、叶的黄酮醇苷成分，以紫外分光光度法、HPLC及氨基酸分析仪分别对牛大力根、茎、叶的总黄酮、多糖、黄酮醇苷、异黄酮、氨基酸成分进行定量分析，阐明牛大力黄酮类的组织分布情况;以牛大力根、茎、叶为材料，通过比较转录组解析牛大力各器官中黄酮、异黄酮、多糖、氨基酸的生物合成相关基因的表达情况;通过相关差异表达基因(DEG)与对应成分的相关性分析解释这些成分的组织分布;通过保守基序分析和系统发育树构建，寻找可能调控牛大力黄酮及多糖生物合成的MYB和bHLH转录因子;对候选关键基因进行克隆及原核表达并考察其酶促动力学参数。 成果: 1.通过LC-MS对牛大力根、茎、叶的总黄酮部位进行代谢组分析，鉴定出2个黄酮醇苷:异槲皮苷和异鼠李素-3-O-葡萄糖苷，HPLC法含量测定结果显示，该两个成分的器官分布情况相似，均为叶＞茎＞根; 2.牛大力茎、叶总黄酮含量接近，且显著高于根的含量;高丽槐素、芒柄花素、多糖、氨基酸均在根中含量较高; 3.通过RNA-seq获取了牛大力根、茎、叶的转录组数据，经过筛选得到:46个黄酮合成通路上游的关键基因，14个为PAL(4个DEG)、32个为4CL(7个DEG);77个黄酮类生物合成途径上的结构基因，其中28个为DEG;7个异黄酮结构基因，其中2个为DEG;218个多糖生物合成途径的结构基因，其中20个为DEG;261个药效氨基酸生物合成途径上的结构基因，其中20个为DEG;相关性分析结果提示，上述成分均可能存在合成与富集部位不一致的情况; 4.筛选到29个R2R3-MYB转录因子、98个bHLH转录因子;其中，MspR2R3-MYB26属于第6亚组，具备[DE]Lx2[RK]x3Lx6Lx3R基序，可能参与了牛大力黄酮生物合成调控;另外，牛大力转录组中可能参与到黄酮类生物合成途径的bHLH包括:Ⅲ(d+e)亚组中的bHLH14、bHLH19、bHLH20、bHLH52、bHLH77、bHLH78、bHLH87;Ⅲf亚组的bHLH80、bHLH30、bHLH69;Ⅶ(a+b)亚组的bHLH92、bHLH41、bHLH29、bHLH85、bHLH79、bHLH1、bHLH5。 5.成功克隆并原核表达出两个查尔酮异构酶MspCHI1（typeⅡCHI）和MspCHI2（typeⅠCHI）;对两个重组蛋白进行酶促动力学考察，得到了重组蛋白MspCHI1催化异甘草素的Km值为49.82μM，Vmax值为117.21nmol·min-1。重组蛋白MspCHI1催化异甘草素的Km值为32.54μM，Vmax值为279nmol·min-1。重组蛋白MspCHI2催化柚皮素查尔酮的Km值为32.95μM，Vmax值为131.43nmol·min-1。 结论: 1.异黄酮成分（高丽槐素、芒柄花素）及多糖作为牛大力的质量指标，根部含量高于茎、叶，支持牛大力以根入药的传统用法;此外，牛大力茎、叶总黄酮含量显著高于根部，可以考虑围绕黄酮类进行牛大力地上部分资源的综合开发，提高牛大力产业的附加值。 2.牛大力中可能存在着黄酮在根部合成后大量运输到其他器官的情况。CHI3及多个CHS均在根部高表达，而两个异黄酮成分也在根部富集，这些基因可能参与了牛大力异黄酮的生物合成;推测牛大力多糖合成过程为:茎枝从叶片接收了光合产物，逐渐转化为NDP，最后经由GT催化生成了终产物多糖，贮存于根部;MspMYB26含有能形成MYB-bHLH复合体交互作用功能的基序，可能参与了黄酮生物合成的调控;牛大力可能参与黄酮生物合成调控的bHLH转录因子分布于Ⅲ(d+e)、Ⅲf、Ⅶ(a+b)亚组。 3.MspCHI1是可催化异甘草素生成甘草素、催化柚皮素查尔酮生成柚皮素;MspCHI2可催化柚皮素查尔酮生成柚皮素。其中，MspCHI1可能参与了牛大力异黄酮生物合成。
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