摘要
L-缬氨酸作为人和动物的八种必需氨基酸之一，已经越来越广泛地应用到食品、医药、饲料等多个专业领域。随着市场对L-缬氨酸需求的逐渐增加，微生物发酵法逐渐成为了生产L-缬氨酸的主要途径。而L-缬氨酸在大规模的发酵生产中，仍旧面临着产酸率低、糖酸转化率低、副产物高等问题。因此，针对L-缬氨酸的发酵生产研究进行一系列的优化提高具有非常重要的现实意义。本研究以L-缬氨酸生产菌XV0505(Leu-+Ile-+2-TAr+α-ABr+SGr)为生产菌株，针对目前生产工艺中菌株特性、培养基成分、发酵过程控制等方面存在的问题，提出了一些建设性的改进方案，进行了有关于L-缬氨酸定向改造及发酵过程精准控制的研究，主要研究结果如下: (1)菌种改造:为了最大限度的去除L-缬氨酸发酵生产过程中副产物L-丙氨酸的产生，采用基因编辑技术，敲除了L-丙氨酸相关合成的酶的基因avtA和alaT，在摇瓶中与出发菌株进行对比试验，最终经改造后的菌株副产物丙氨酸合成量减少了51.2％。 (2)培养基优化:为了进一步提高L-缬氨酸的产量以及转化率，对L-缬氨酸发酵培养基进行了优化，对L-缬氨酸发酵过程中所添加的生物素和氯化胆碱的含量以及两者的添加方式进行探究，确定了最优的方案。实验对比优化前后的L-缬氨酸产量以及糖酸转化率，结果显示，在进行了生物素与氯化胆碱的添加优化之后，L-缬氨酸的发酵产量为86.2g/L，相对于原始培养基提高了34.7％;糖酸转化率为36.5％，相对于原始培养基，提高了9.2％。优化后的培养基更适合L-缬氨酸的发酵生产。 (3)发酵过程控制优化:为进一步降低L-缬氨酸发酵生产过程中副产物L-丙氨酸的产量，本研究设计了膜偶联在线透析发酵，葡萄糖限量供应发酵，以及恒容发酵3种控制工艺。与常规控制方式发酵批次相比，膜偶联在线透析发酵的总产酸量提高了47.4％，糖酸转化率提高了2.5％，同时，副产物L-丙氨酸的产量降低了75％;与常规控制方式发酵批次相比，葡萄糖限量供应发酵工艺糖酸转化率提高了1％，副产物丙氨酸的产量降低了48.3％;与常规发酵工艺相比，恒容发酵产酸周期延长了38.5％，单批次发酵产酸总量提高了79.3％，单位时间内的产酸效率提高了25.8％，糖酸转化率提高到40％左右，同时副产物L-丙氨酸的浓度下降了85％。这3种实验方案均适合用于降低L-缬氨酸发酵生产中L-丙氨酸的含量。 本研究将上游与中游结合，从菌种到发酵工艺进行了全面的改进，有效提高了微生物发酵生产L-缬氨酸的工艺水平，为L-缬氨酸的工业化生产提供了有价值的参考。
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