银腺杨（84K）组氨酸激酶基因PaHK3a和PaHK3b的功能研究

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中文摘要：植物受到干旱、高盐等逆境胁迫后，体内会产生一系列的生理生化响应使植物能够维持正常生长。在此过程中信号转导因子、转录因子等发挥着重要作用。它们能够接收信号并传递给下游转录因子来调控基因表达。组氨酸激酶属于蛋白激酶家族，是植物双组分系统的重要组成部分，能与细胞分裂素结合，对植物生长发育进行调节，如植物细胞分化、叶片衰老调控及根系伸长等。研究表明，组氨酸激酶能够在植物抵御干旱、高盐等非生物胁迫中也发挥重要作用。多年生木本植物，生长周期较长，且需要长期应对非生物胁迫，但组氨酸激酶是否在木本植物抗逆胁迫反应中起作用尚未见报道。本研究以银腺杨‘84K’(Populusalba×P.glandulosa‘84K’)为材料，检测了其组氨酸激酶基因PaHK3a、aHK3b基因在不同植物激素处理及非生物胁迫处理下的表达情况，测定了干旱、盐胁迫下‘84K’杨叶片丙二醛含量、保护酶活性等生化指标，并通过原核表达方法对PaHK3b基因抗旱耐盐功能进行了初步鉴定;构建了PaHK3a、PaHK3b基因CRISPR/Cas9基因编辑植物表达载体，并进行了‘84K’杨遗传转化，获得了一批转基因植株。论文主要研究结果如下: 1.克隆了PaHK3b基因CDS序列及其启动子序列，预测了蛋白结构及启动子顺式作用元件。PaHK3b基因编码蛋白具有CHASE等典型的细胞分裂素受体结构域，启动子区域含有防御与胁迫响应元件TC-richrepeats、赤霉素响应元件GARE-motif等多个参与非生物胁迫和激素信号转导的顺式作用元件，表明PaHK3b基因与杨树植物激素信号及非生物胁迫信号响应密切相关。 2.通过非生物胁迫和植物激素处理，分析了PaHK3a、PaHK3b基因非生物胁迫和植物激素诱导下的表达模式。qRT-PCR分析结果显示，PaHK3a、PaHK3b基因在根、茎、叶中均有表达，且在叶片中表达量最高。在高温、低温、干旱、盐胁迫等非生物胁迫处理下，PaHK3a、PaHK3b基因均上调表达，在6-BA、ABA、GA3及水杨酸植物外源激素处理下，PaHK3a、PaHK3b基因均下调表达，而IBA处理下，基因表达均与对照差异不大。因此，杨树PaHK3b基因参与杨树植物激素信号响应，并在其抗逆境胁迫过程中发挥重要调控作用。 3.检测了温室干旱、盐胁迫处理下‘84K’杨叶片丙二醛含量、保护酶活性等生理指标及PaHK3a、PaHK3b基因表达情况。在温室干旱、盐胁迫处理过程中，PaHK3a、PaHK3b基因表达均显著高于对照，呈现先上升后下降的表达模式，MDA含量也呈现类似的趋势，而SOD活性则随处理时间的延长而持续升高，POD活性在干旱胁迫时呈先上升后下降，而在盐胁迫时呈上升趋势。另外，PaHK3a、PaHK3b基因与MDA含量、SOD、POD活性均呈正相关性。因此，‘84K’杨生理指标与PaHK3a、PaHK3b基因密切相关，说明PaHK3a、PaHK3b基因在杨树抗旱耐盐反应中起重要调控作用。 4.通过构建原核表达载体，并转入大肠杆菌表达系统，初步鉴定了PaHK3b基因的抗逆功能。在添加5％PEG6000的LB液体培养基中，含有PaHK3b基因重组质粒的大肠杆菌菌株生长速度高于含有空载体的对照菌株，在添加50～150mmol·L-1NaCl的LB固体培养基上，含有PaHK3b基因重组质粒的大肠杆菌菌株单克隆生长均优于对照。因此，进一步证明了PaHK3b基因在干旱、盐胁迫下发挥重要调控作用。 5.构建了YLCRISPR/Cas9-DH-PaHK3a、pYLCRISPR/Cas9-DH-PaHK3b植物表达载体，并通过遗传转化获得转基因植株。在PaHK3a、PaHK3b基因的编码区分别设计两个靶点，构建了植物表达载体pYLCRISPR/Cas9-DH-PaHK3a和pYLCRISPR/Cas9-DH-PaHK3b。采用农杆菌介导法对‘84K’杨进行遗传转化，经潮霉素抗性筛选分别得到PaHK3a基因编辑抗性芽750个、抗性植株80株;PaHK3b基因编辑抗性芽900个、抗性植株107株、转基因植株38株。综上所述，本研究初步确定了杨树组氨酸激酶基因PaHK3a、PaHK3b参与杨树植物激素激素信号响应，并在其抗逆境胁迫过程中发挥重要调控作用。为深入研究PaHK3a、PaHK3b基因的功能奠定基础，为杨树抗逆分子育种提供基因资源。

作者：

鲁俊倩

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关键词：

银腺杨组氨酸激酶 PaHK3a基因 PaHK3b基因功能分析

授予学位：

硕士

学科专业：

林木遗传育种

导师：

张冰玉

学位年度：

2020

学位授予单位：

中国林业科学研究院

语种：

中文

中图分类号：