摘要
芪龙胶囊（国药准字Z20000097，医保乙类）以“益气活血”立法，补气与活血并重，主要用于气虚血瘀证缺血性中风病。但芪龙胶囊在真实世界临床实践中的临床疗效尚未有过评价，且疗效机制尚不清楚。中药复方具有成分复杂、靶点通路多样等特点。为解决芪龙胶囊在真实世界中临床疗效不明确的临床问题，及其疗效机制不清楚的科学问题，本研究通过前瞻性队列研究证明了芪龙胶囊在真实临床实践中的临床疗效，并采用RNA测序（RNA-sequencing，RNA-Seq）技术与实时荧光定量PCR(Real-timequantitativepolymerasechainreaction，RT-qPCR)验证技术，筛选出芪龙胶囊发挥疗效所调控的关键基因以及信号通路与生物过程。本研究为芪龙胶囊临床精准定位于气虚血瘀证缺血性中风病提供了真实世界证据，并从转录组学层面揭示了芪龙胶囊“多成分-多靶点-多通路”的疗效机制，为临床精准定位于气虚血瘀证缺血性中风病提供了生物学客观依据。 目的 通过前瞻性队列研究，评价芪龙胶囊在真实临床实践中治疗气虚血瘀证缺血性中风病的临床疗效，并采用RNA-Seq高通量测序与RT-qPCR验证技术，筛选芪龙胶囊调控的关键基因以及信号通路与生物过程，阐释其疗效机制。 方法 1.芪龙胶囊治疗气虚血瘀证缺血性中风病的前瞻性队列研究:研究对象为气虚血瘀证缺血性中风患者，以服用芪龙胶囊为暴露因素，形成暴露组与非暴露组，所有入组患者均进行基础治疗;总样本量不少于2249例;主要结局指标为Rankin评分量表(mRS评分)、美国国立卫生院神经功能缺损评分(NationalInstituteofHealthstrokescale，NIHSS)和Barthel指数量表(BI评分)，次要结局指标包括中医证候（气虚证评分、血瘀证评分）、心理指标（抑郁自评量表SDS评分、焦虑自评量表SAS评分）、血脂指标、凝血指标、同型半胱氨酸;分别于治疗结束后第12周、24周对患者进行现场随访以评估疗效。使用插补法处理缺失数据，使用倾向性评分匹配法(PropensityScoreMatching，PSM)处理混杂因素，通过差值检验法、对齐秩转换方差分析(AlignedRanksTransformationANOVA，ARTANOVA)、广义线性混合模型(GeneralizedLinearMixedModel，GLMM)评价临床疗效。研究结果遵循STROBE-cohortstudy规范进行报告。 2.基于RNA-Seq高通量测序的芪龙胶囊干预后差异表达mRNA研究:(1)血样为临床试验中分别于基线与芪龙胶囊治疗12周后所取患者的全血，采血管为2.5mlPaxgeneBloodRNAtube，依据患者12周治疗后NIHSS评分、mRS评分降低数值最大且BI评分提高数值最大筛选原则，选取了20名患者治疗前后的全血，共计40个血样。(2)治疗前分组为20名患者治疗前血样（20个生物样本重复），治疗后分组为此20名患者服用芪龙胶囊治疗12周后血样(20个生物样本重复)。除主分析组外，还依据患者临床特征进行了亚组的设置，包括性别（男、女）、年龄（年龄≤60岁、年龄＞60岁）、初发与复发。(3)实验方法主要为样本总RNA提取、总RNA质控、文库构建与测序、测序数据的过滤与质控、差异基因检测、差异基因富集分析6个过程。(4)差异基因筛选使用DEGseq方法，为了提高筛选的准确性，我们定义log2FoldChange≥1并且Q-value≤0.001的基因，筛选为芪龙胶囊干预后显著差异表达基因。(5)对差异基因进行GO功能与KEGGPathway富集分析，计算得到的P-value分别通过Bonferroni与FDR校正后，以P-value或Q-value(correctedP-value)＜0.05为阈值，满足此条件的GOterm和Pathway定义为在候选基因中显著富集的GOterm与KEGGPathway，通过G0功能与KEGGPathway显著性富集分析能确定差异基因行使的主要信号转导途径与生物学功能。 3.基于RT-qPCR的芪龙胶囊干预后关键基因与调控机制研究:(1)选取测序结果中差异表达显著性大且基因表达量较高的基因AREG、CAV2、PEDS1-UBE2V1、MYL9、ITGA2B、CXCL8、LY96、GNG10、CXCL10进行验证，以β肌动蛋白(β-actin)为内参基因。(2)选取RNA-Seq高通量测序部分同一批患者血样RNA进行验证实验，共10名患者（女性3例、男性7例;年龄≤60岁5例、年龄＞60岁5例;初发6例、复发4例），20个血样RNA进行验证（治疗前、治疗后）。(3)实验方法包括样本总RNA质检、mRNA逆转录、实时荧光定量PCR扩增（序列与引物设计、PCR反应体系）。(4)使用2-⊿⊿Ct法分析实时定量PCR实验中目标基因干预后表达相对变化，将治疗前和治疗后各10个样本的三次重复平均Ct与平均内参Ct统一计算为两组的均值，然后以治疗前为对照(2-⊿⊿Ct=1)，计算每个目标基因在治疗后与治疗前中表达量比值2-⊿⊿Ct，若比值＞1，则干预后此基因表达量上调;若比值＜1，则表达量下调。以此判断验证的目标基因与转录组测序上下调趋势是否一致。同时结合转录组测序富集结果，阐释关键基因调控的主要信号通路与生物过程。 结果 1.芪龙胶囊治疗气虚血瘀证缺血性中风病的前瞻性队列研究:(1)从2016年11月3日～2019年1月16日，共筛选了2468例患者，基线入组时因不符合入组标准排除97例，共2371例患者进入研究队列，第12周、24周随访共剔除与失访69例，最终纳入分析合格病例2302例（暴露组1260例、非暴露组1042例）。(2)2302例全数据集治疗前后差值组间比较:①在治疗后第24周，芪龙胶囊联合基础治疗在降低mRS评分、NIHSS评分、气虚证评分、血瘀证评分、SDS评分、SAS评分和提高BI评分方面优于单用基础治疗(P＜0.05);②在治疗后第12周，芪龙胶囊联合基础治疗在降低总胆固醇含量方面优于单用基础治疗(P＜0.05)。(3)PSM600例子数据集治疗前后差值组间比较:①在治疗后第24周，芪龙胶囊联合基础治疗在降低mRS评分、NIHSS评分、气虚证评分、血瘀证评分、SAS评分和提高BI评分方面优于单用基础治疗(P＜0.05);②在治疗后第12周，芪龙胶囊联合基础治疗在降低甘油三酯含量方面优于单用基础治疗（P＜0.05）。(4)600例子数据集对齐秩转换方差分析模型:三次测量的主要结局指标分析结果显示，mRS评分和BI评分在分组的P值小于0.05，说明mRS评分和BI评分各组的数据的差异有统计学意义，而分组和测量次数交互作用的P值大于0.05，说明测量次数和分组无交互作用;NIHSS评分在测量次数的P值小于0.05，则说明NIHSS评分在各个测量时间的数据的差异有统计学意义，而分组和测量交互作用的P值大于0.05，说明测量次数和分组无交互作用。(5)广义线性混合模型分析:分别在2302例全数据与600例子数据集进行mRS评分、NIHSS评分、BI评分建模，结果显示:①在mRS评分方面，600例子数据集中暴露组受试者mRS评分的oddsratio的估计随时间每次下降99.83％，非暴露组的受试者mRS评分的oddsratio的估计随时间每次下降95.8％，暴露组患者的mRS评分下降速度快于非暴露组，且差异显著(P＜0.05);2302例全数据集结果显示，暴露组受试者mRS评分的oddsratio的估计随时间每次下降99.82％，非暴露组受试者mRS评分的oddsratio的估计随时间每次下降97％，暴露组患者的mRS评分下降速度快于非暴露组，且差异有统计学意义(P＜0.05)。②在NIHSS评分方面，600例子数据集结果显示，暴露组受试者NIHSS评分的oddsratio的估计随时间每次下降99.98％，非暴露组受试者NIHSS评分的oddsratio的估计随时间每次下降99.77％，暴露组受试者的NIHSS评分下降速度快于非暴露组，且差异有统计学意义（P＜0.05）;2302例全数据集结果显示，暴露组受试者NIHSS评分的oddsratio的估计随时间每次下降99.99％，非暴露组受试者NIHSS评分的oddsratio的估计随时间每次下降99.97％，暴露组患者的NIHSS评分下降速度快于非暴露组，且差异有统计学意义(P＜0.05)。③在BI评分方面，600例子数据集结果显示，暴露组患者的BI评分上升速度快于非暴露组，且差异有统计学意义(P＜0.05)。 2.基于RNA-Seq高通量测序的芪龙胶囊干预后差异表达mRNA研究:(1)40个样本总RNA平均浓度为282.08ng/μL，平均总量为5.61μg;RIN值除了两个样本为6.6和5.1，其余均高于7，28S/18S在1.3～2.9之间，表明40个总RNA纯度和完整度较高，符合后续建库与测序的要求。(2)使用DNBSEQ平台进行测序，40个样品共产出1869.27Mb原始数据，原始数据经过过滤后，共有1619.21Mb(86.62％)的原始数据作为高质量读段(Cleanreads)被保留下来，说明测序数据结果较好，大部分读段被保留下来，且样本间Cleanreads差异较小，可用于后续分析。(3)显著差异基因检测结果显示，主分析组干预后检测到的差异基因有39个;男性亚组检测到的差异基因有40个;女性亚组检测到的差异基因有151个;年龄≤60岁亚组检测到的差异基因有61个;年龄＞60岁亚组检测到的差异基因有84个;初发亚组检测到的差异基因有52个;复发亚组检测到的差异基因有102个。(4)富集分析显示，芪龙胶囊主要通过调控以下5个方面信号通路与生物功能改善患者炎症与动脉粥样硬化情况，修复神经功能缺损。分别为:①免疫反应（LY96、CXCL8、CXCL10等参与免疫反应调节，LY96、HP、HLA-DRB5等参与免疫系统过程）;②炎症反应相关信号通路（LY96、CXCL8、CXCL10等参与炎症反应调控，AREG、ITGA2B、FN1等参与PI3K-AKT信号通路调控，ITGA2B、FN1、GP1BB等参与ECM-受体相互作用调控，AREG、CAV2参与MAPK级联反应的正调控，GNG10、CXCL10、CXCL8等参与趋化因子信号通路调控，PEDS1-UBE2V1、CXCL8、CXCL1等参与IL-17信号通路调控，LY96、CXCL8、CCL4L1等参与NF-κB信号通路调控，LY96、CXCL8、CAV1等参与Toll样受体信号通路调控，CXCL8、CXCL1、CCL4L1等参与到细胞因子受体的相互作用，FN1、ARG1、CAV1等参与到TGF-β信号通路，DAAM2、CAV1、BAMBI等参与Writ信号通路调控）;③动脉粥样硬化调控(CAV2、ITGA2B、GSTT1等参与流体剪切应力与动脉粥样硬化调控);④细胞相关功能调控(AREG、CAV2、IGFBP2等参与到细胞增殖与分化调控，CXCL8、E2F1、KIR2DL1等参与到细胞衰老，HBA1、HBB、HP等参与到细胞凋亡及清除，CAV2、ITGA2B、CAV1等参与细胞粘附调控，ITGA2B、MYL9、FN1等参与白细胞迁移调控）;⑤血压调节(AREG、KLK1、HBB等参与到血压调节)。 3.基于RT-qPCR的芪龙胶囊干预后关键基因与调控机制研究:(1)20个样本浓度在200-700ng/μl之间，纯度在2.0-2.3之间，浓度与纯度符合下一步反转录和扩增实验要求，且电泳检测所有样本RNA质量显示良好。(2)PCR扩增后，扩增曲线图显示目的基因和内参的扩增效率基本一致;熔解曲线是单峰，说明产物只有一条，特异性较好，PCR扩增结果较好。(3)RT-qPCR结果显示，基因AREG、CAV2、ITGA2B、PEDS1-UBE2V1、MYL9在治疗后的表达量比值2-⊿⊿Ct均大于1，即相对于治疗前在干预后的表达量上调;基因LY96、GNG10在治疗后的表达量比值2-⊿⊿Ct均小于1，即相对于治疗前在干预后的表达量下调。(4)基因AREG、CAV2、PEDS1-UBE2V1、MYL9、ITGA2B、LY96、GNG10的表达水平与RNA-Seq高通量测序相应基因的上下调趋势一致，一方面说明AREG、CAV2、PEDS1-UBE2V1、MYL9、ITGA2B、LY96、GNG10可能是芪龙胶囊调控的关键基因;另一方面说明RT-qPCR验证结果与RNA-Seq高通量测序结果整体一致性较高，测序结果比较可靠。依据转录组测序富集分析结果发现，芪龙胶囊通过以上关键基因参与到免疫反应、炎症反应相关信号通路、动脉粥样硬化、细胞相关功能、血压调节等关键信号通路与生物过程调控。 结论 1.在常规治疗基础上，使用芪龙胶囊治疗气虚血瘀证缺血性中风患者可显著降低mRS评分、NIHSS评分、气虚证评分、血瘀证评分、SDS评分、SAS评分、总胆固醇含量、甘油三酯含量并提高BI评分，改善神经功能缺损、气虚血瘀与抑郁焦虑情况，降低患者血脂，提高患者日常生活能力，且安全性较好。真实世界临床实践中，芪龙胶囊临床精准定位于气虚血瘀证缺血性中风病疗效显著。 2.芪龙胶囊治疗气虚血瘀证缺血性中风患者主要通过调控AREG、CAV2、PEDS1-UBE2V1、MYL9、ITGA2B、LY96、GNG10等关键基因的表达，参与免疫反应、炎症反应相关信号通路（炎症反应调控、PI3K-AKT信号通路、ECM-受体相互作用、MAPK级联反应的正调控、趋化因子信号通路、IL-17信号通路、NF-κB信号通路、Toll样受体信号通路）、动脉粥样硬化调控、细胞相关功能（细胞增殖与分化、细胞粘附、白细胞迁移）、血压调节等关键信号通路与生物过程，改善患者的炎症与动脉粥样硬化情况，促进神经细胞与组织再生，恢复神经功能，提高日常生活能力。其中君药黄芪与免疫反应、炎症反应相关信号通路与动脉粥样硬化调控相关，君药地龙与动脉粥样硬化调控、细胞相关功能、血压调节相关，臣药丹参、当归、赤芍、川芎、红花、桃仁与炎症反应相关信号通路、动脉粥样硬化调控、细胞相关功能、血压调节相关。芪龙胶囊在以上药物配伍作用下，以益气活血、化瘀通络立法，共同参与到以上5个关键信号通路与生物过程。本研究从转录组水平阐释了芪龙胶囊临床精准定位于气虚血瘀证缺血性中风病的疗效机制。 创新点 1.将倾向性评分匹配法与对齐秩变换方差分析、广义线性混合模型相结合，通过前瞻性队列研究证实了真实临床实践中芪龙胶囊治疗气虚血瘀证缺血性中风病的临床疗效，为临床精准定位于气虚血瘀证提供了真实世界证据; 2.采用RNA-Seq高通量测序技术与RT-qPCR验证技术，发现芪龙胶囊主要通过调控AREG、CAV2、PEDS1-UBE2V1、MYL9、ITGA2B、LY96、GNG10等关键基因的表达，参与免疫反应、炎症反应相关信号通路、动脉粥样硬化、细胞相关功能、血压调节等关键通路与生物过程，初步阐释了芪龙胶囊的“多成分-多靶点-多通路”的疗效机制，为临床精准定位提供了生物学客观依据。
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