摘要
研究背景: 2型糖尿病是由多种病因引起人体内胰岛素分泌不足或者胰岛素抵抗，其慢性并发症主要包括大血管、微血管和神经等病变。其中糖尿病性微血管病变是引起糖尿病足、坏疽、截肢致残的主要诱发因素。主要的病理生理基础是内皮细胞结构和功能受损而导致血管通透性增加、脂质沉积，动脉粥样硬化形成，故内皮损伤、血管通透性增加是导致2型糖尿病血管病变中的一个关键的病理基础。最近的报道表明干细胞抑制细胞凋亡，促进内皮细胞迁移增殖，并参与血管新生的整个过程，旁分泌信号被认为是干细胞治疗作用背后的主要潜在机制之一。而外泌体是细胞间通讯的重要旁分泌因子。外泌体直径小、无细胞核结构优点，从而避免了由直接移植的干细胞所导致的一部分不良事件发生。外泌体包含丰富的蛋白质和miRNA可以改善内皮细胞损伤，外泌体改善微血管病变疗效和机制鲜有报道。 研究目的: 本研究旨在探讨间充质干细胞外泌体对糖尿病小鼠微血管病变的治疗作用并探讨其潜在机制。 研究方法: 1、采用超速离心法提取脐带间充质干细胞外泌体，并采用透射电镜观察外泌体形态、粒径分析检测外泌体直径分布和westernblot鉴定外泌体特异蛋白。 2、DB/DB小鼠随机分为PBS组和外泌体组，分别尾静脉注射PBS和外泌体，尾静脉注射28天后取下肢腓肠肌肌肉组织进行0.5％伊文思蓝荧光评估微血管通透性，免疫组化观察肌肉组织Ki67、Bax和bcl-2的表达，免疫荧光检查CD31的表达，透射电镜评估下肢肌肉组织微血管形态及功能。 3、TMT蛋白组学检测PBS组和外泌体组下肢肌肉组织差异蛋白表达变化，进行数据分析，筛查关键信号分子及其涉及的生物学通路，westernblot进行关键信号分子CD105验证。Westernblot评价外泌体TGF-β的表达。 研究结果: 1、电镜显示脐带间充质干细胞外泌体呈大小均一的囊泡结构，粒径分析检测显示直径集中在160nm左右，westernblot显示特异蛋白CD9、CD63、TSG101表达阳性; 2、外泌体治疗前后糖尿病小鼠血糖、体重无明显变化，伊文思蓝荧光显示外泌体组可以显著减少伊文思蓝从肌肉组织微血管中的渗出。与PBS组相比，外泌体组下肢肌肉组织中的Bax表达明显降低，而Ki67、Bcl-2表达升高。同时CD31免疫荧光显示外泌体治疗红色荧光明显增加，高于PBS组。透射电镜显示外泌体组毛细血管管腔光滑，内皮细胞表面平滑、完整，PBS组毛细血管管腔狭窄，内皮细胞指状突起。 3、TMT蛋白质组学定量分析结果显示有82种差异蛋白质，其中49个下调蛋白和33个上调蛋白，并对差异蛋白进行GO富集分析，结果发现涉及分子功能、生物学过程、细胞组分，其中CD105是上调蛋白之一，通过文献检索，发现CD105与内皮细胞增殖有关，因此本研究验证了外泌体组CD105的变化，并作为本次实验的机制研究。 4、Westernblot检测显示外泌体组下肢肌肉组织中CD105蛋白的表达较PBS组显著增加。基于CD105是TGF-β受体复合物成分之一，外泌体富含生长因子和细胞因子，本研究进一步检测了外泌体中TGF-β的表达，结果显示外泌体高表达TGF-β。 结论: hUCMSCs外泌体可以通过提高微血管内皮细胞完整性改善糖尿病下肢肌肉组织微血管的通透性，促进下肢肌肉组织细胞增殖、抑制组织细胞凋亡。机制可能与外泌体富含TGF-β，TGF-β很可能是通过与内皮细胞CD105/TβR-Ⅱ受体复合物结合，促进内皮细胞增殖，改善通透性，同时促进血管新生，保护骨骼肌细胞免受凋亡。
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