摘要
背景: “瘀证”是腰痛最常见的病机之一，现代医学发现氧化应激环境、炎症因子浸润是“瘀证”最重要的表现，而椎间盘退变(Intervertebraldiscdegeneration，IDD)作为诱发腰痛最主要的因素之一，氧化应激与炎症刺激也是IDD的重要致病因素，而外界刺激致髓核(Nucleuspulposus，NP)细胞的凋亡，进而造成细胞外基质(Extracellularmatrix，ECM)的降解是IDD的主要表现。“祛瘀生新”法是“瘀证”的主要治法之一，其微观表现为改善细胞组织的氧化应激、炎症刺激等环境，从而减少细胞凋亡，促进组织新生;三七作为治疗“瘀证”腰痛最主要的活血化瘀药物之一，其主要起效成分三七总皂苷(PanaxNotoginsengsaponins，PNS)已被证实具有抗氧化、抗炎等多种作用，基于“祛瘀生新”法，PNS对IDD的治疗理论上存在可行性，但报道很少，没有足够的分子生物学证据。 目的: 分别从生信、细胞、动物三个层面探究“祛瘀生新”法理论指导下，PNS对IDD治疗效用及分子机制:1.从网络药理学分析PNS和IDD的交集靶点，预判信号通路，提供生信层面的理论支持;2.从细胞水平验证PNS对氧化应激环境下NP细胞的作用及机制;3.从细胞水平验证PNS在炎症刺激下对NP细胞的作用及机制;4.从动物水平验证PNS在IDD动物模型中的疗效。 方法: 1.检索中药系统药理学数据库与分析平台以获得PNS的化合物成分信息，通过SwissTargetPrediction数据库对PNS的靶点进行预测，并从GeneCards数据库获取IDD的治疗靶点，采用Venny2.1对PNS和IDD的靶点取交集，然后采用Cytoscape3.7.2进行活性成分-靶点网络构建，Metascape数据库进行交集靶点的GO功能富集分析和KEGG通路富集分析;2.采集临床患者的退变椎间盘的手术标本，分离NP组织进行离体NP细胞培养，采用H2O2诱导人NP细胞(HumanNP,HNP)氧化应激状态，观察PNS对HNP细胞的保护作用:①CCK8检测PNS和H2O2对HNP细胞的活性影响情况;②TUNEL检测HNP细胞在H2O2刺激下伴或不伴PNS干预的细胞凋亡情况;③PCR检测MMP13、ADAMTS-5、COL2A1、ACAN的基因表达水平;④WestemBlot(WB)检测Cleaved-caspase3、Bax/Bcl-2、MMP13、ADAMTS-5、COL2A1、ACAN、p-mTOR、p-Akt、LC3Ⅰ/Ⅱ、P62、Atg7的蛋白表达水平;⑤免疫荧光检测Cleaved-caspase3、MMP13、COL2A1、ACAN，溶酶体的表达情况;3.采用IL-1β诱导HNP细胞的炎症反应，观察PNS对HNP细胞的保护作用:①PCR检测IL-1β对HNP细胞的iNOS、COX-2、MMP13、COL2A1、ACAN基因水平的影响;②PCR检测PNS干预下，IL-1β对HNP细胞的iNOS、COX-2、IL-6、MMP1、MMP3、MMP13、ADAMTS-5、COL2A1、ACAN基因水平的影响;③WB检测PNS干预下，IL-1β对HNP细胞的COX-2、MMP13、ADAMTS-5、COL2A1、ACAN蛋白表达的影响;④免疫荧光和WB检测PNS对IL-1β刺激下的HNP细胞在NF-κB信号通路的P65磷酸化和核转位情况;4.构建3月龄SD雄性大鼠尾椎间盘穿刺IDD模型，PNS(160mg/Kg、200mg/Kg)进行腹腔注射给药，在4周和8周分别进行尾椎的MRI扫描及H&E染色，观察PNS的体内作用。 结果: 第一部分研究:1.PNS主要成分为5种单体，notoginsenosideR1、ginsenosideRg1、ginsenosideRe、ginsenosideRb1、ginsenosideRd，除了ginsenosdieRb1外，其余均显示有较高的类药(DL)性，尤其是ginsenosideRg1和ginsenosideRdqt的DL值均高于0.18;在分子质量(MW)，极面面积(TPSA)，和可旋键数目(RBN)三类参数上，ginsenosideRdqt表现出比其它成分更良好的药物性;2.通过SwissTargetPrediction分析出每种化合物的100个预测靶点，通过GeneCards以“discdegeneration”检索出靶点数3652个，筛选获得891个Uniprot号;3.Cytoscape获得交集靶点42个;GO富集分析包括分子功能，生物过程及细胞构成，通路分析显示PI3K/Akt、凋亡通路、自噬信号通路可能是相关机制;4.拓扑分析识别出Caspase3，Akt1，STAT3，EGFR，JUN，MAPK1，VEGF,MMP1/9/13，PLG为关键节点，其中Caspase3，Akt1，MAPK1，MMP1/9/13等都是亚网络的组分，提示其重要作用。 第二部分研究:1.PNS及H2O2的细胞毒性实验:①不同浓度的PNS干预24h与空白对照组比较，细胞活性无明显差异(P＞0.05);②不同浓度的H2O2(1％FBS-DMEM/F12稀释)分别干预6h，12h，24h，干预6h时，各H2O2组与对照组比较细胞活力明显降低(P＜0.05)，400μM组活力下降更加明显(P＜0.01);干预12h时，各干预组活力进一步降低（100μM，200μM，P＜0.01;300μM，400μM，P＜0.001）;干预24h时，各组的细胞活性较对照组均大幅下降(P＜0.0001);⑨H2O2(+)/PNS(-)组、H2O2(+)/PNS（0.01μg/ml）组、H2O2(+)/PNS(0.1μg/ml)组的细胞活性较空白对照组极明显降低(P＜0.0001)，H2O2(+)/PNS(1tg/ml)及H2O2(+)/PNS(10μg/ml)组较空白对照组细胞活性也有明显降低(P＜0.05);与H2O2(+)/PNS(0.01μg/ml)组及H2O2(+)/PNS(0.1tg/ml)组比,H2O2(+)/PNS(1μg/ml)及H2O2(+)/PNS(10μg/ml)组的细胞活性明显增加(P＜0.05)。2.TUNEL检测细胞凋亡:H2O2组比对照组的凋亡细胞明显更多(P＜0.01)，而PNS(+)/H2O2(+)组的细胞凋亡百分率比H2O2组明显减少(P＜0.01);3.Cleaved-caspase3的IF结果显示显示PNS(-)/H2O2(+)的荧光强度明显高于对照组（P＜0.0001），而PNS(+)/H2O2(+)Cleaved-caspase3的荧光强度虽然高于对照组（P＜0.05），但却仍低于PNS(-)/H2O2(+)，其WB结果显示在PNS(-)/H2O2(+)的表达比对照组明显增加(P＜0.01)，PNS(+)/H2O2(+)可抑制C-caspase3的表达(P＜0.05)，Bax/Bcl-2的WB结果显示其比率在H2O2刺激后比对照组明显升高(P＜0.001)，PNS干预后比率明显降低(P＜0.05);4.PCR检测MMP13、COL2A1、ACAN、ADAMTS-5的基因表达情况，受到H2O2刺激的HNP细胞均表现出MMP13、ADAMTS-5的表达升高，而PNS可以一定程度抑制其表达，且与PNS(-)/H2O2(+)相比，MMP13在PNS(+)/H2O2(+)的表达明显更低(P＜0.05)，ADAMTS-5在各组之间没有统计学差异（P＞0.05）;而对细胞外基质COL2A1和ACAN在PNS(-)/H2O2(+)组的表达均受到抑制，比空白对照组明显降低（COL2A1，P＜0.001;ACAN，P＜0.0001），而PNS的干预可部分逆转其表达（COL2A1，P＜0.01;ACAN，P＜0.05）;WB也得出了一致的结论，PNS(-)/H2O2(+)MMP13的表达高于对照组(P＜0.01)，而PNS可抑制其增加(P＜0.05),ADAMTS-5在H2O2的干预下均有比对照组表达增加的趋势，但组间都无统计学差异(P＞0.05)，而PNS(-)/H2O2(+)组ACAN被分解的片段明显高于对照组(P＜0.001)，而PNS可减少其降解(P＜0.05)，相似地，未被降解的COL2A1的在PNS(-)/H2O2(+)组也明显低于对照组(P＜0.01)，而PNS(+)/H2O2(+)可逆转其趋势(P＜0.05);免疫荧光结果显示，PNS(-)/H2O2(+)组比对照组的ACAN、COL2A1表达明显减少（P＜0.0001），MMP13表达明显增多(P＜0.0001)而PNS治疗组能抑制ACAN(P＜0.001)、COL2A1（P＜0.05）的降解，减少MMP13的表达(P＜0.01);5.WB结果显示在PNS(+)/H2O2(+)的p-Akt与p-mTOR的表达较PNS(-)/H2O2(+)组都明显升高(P＜0.05)，而对应的LC3Ⅱ的表达降低(P＜0.05)，P62的消耗减少(P＜0.05)，Atg7的表达有减少趋势，但组间无统计学差异（P＞0.05）;同样，溶酶体的免疫荧光染色结果也提示，PNS减少了H2O2刺激下的溶酶体荧光强度，表明抑制了HNP细胞的自噬(P＜0.05);使用雷帕霉素50nM干预24h的各组的LC3Ⅰ/Ⅱ的转化率均较同组无雷帕霉素干预时显著增加，而H2O2(+)/Rapa(+)/PNS(-)组的LC3Ⅱ表达程度最高，其Bax/Bcl-2的表达也最多，提示自噬增加会诱导更多的细胞凋亡，而联合PNS干预的条件下，LC3Ⅱ的表达有减少趋势，Bax/Bcl-2的表达则明显减少(P＜0.01)，但仍比未使用雷帕霉素干预时Bax/Bcl-2的表达更多(P＜0.0001)。 第三部分研究:1.IL-1β干预4h后可诱导HNP细胞产生的炎性因子iNOS(P＜0.0001)显著升高，COX-2的表达水平也明显增加(1ng/mlP＜0.01，10ng/mlP＜0.05);1ng/ml的IL-1β可抑制COL2A1、ACAN的表达水平(P＜0.05)，可明显增加MMP13的表达水平(P＜0.01);10ng/ml的IL-1β对COL2A1、ACAN、MMP13均无明显抑制作用(P＞0.05);在干预24h后，1ng/ml和10ng/ml的IL-1β均能明显诱导HNP细胞的炎性因子iNOS显著升高(1ng/ml，P＜0.001，10ng/ml，P＜0.0001)，使COX-2的表达水平明显增加(P＜0.001);1ng/mlIL-1β可抑制COL2A1的表达水平(P＜0.01)，而不能明显抑制ACAN的表达(P＞0.05)，而10ng/ml对COL2A1和ACAN表达均无明显抑制（P＞0.05）;两者均可明显增加MMP13的表达水平(1ng/mlP＜0.01，10ng/mlP＜0.05)2.PCR结果提示PNS的治疗对IL-1β诱导产生的iNOS，COX-2，IL-6炎性因子和MMP1，MMP3，MMP13，ADATMS-5分解代谢酶的表达无抑制作用(P＞0.05)，也对COL2A1，ACAN等细胞外基质的降解无缓解作用(P＞0.05);WB的结果与PCR结果一致，在COX-2、MMP13、COL2A1、ACAN、ADAMTS-5的蛋白水平，PNS也并未表现出在抑制炎症、抑制ECM降解方面的更明显的优势(P＞0.05);3.p-P65的免疫荧光结果提示IL-1β处理组比对照组的p-P65表达明显增加(P＜0.001)，而PNS治疗组产生能不能明显减少p-P65的表达(P＞0.05)。 第四部分研究:1.在术后4周、8周，对大鼠Co6/7，Co8/9进行MRI扫描，与空白对照组比较，Co6/7的椎间盘穿刺并未造成明显的IDD改变，Pfirrmann分级为1级;而Co8/9在术后4周的IDD-Saline组IDD里已经表现出Pfirrmann分级3～4级的IDD改变，但在给药组里退变趋势明显更弱，Pfirrmann分级介于1～2级;术后8周，Co8/9在IDD-Saline组退变进一步增加至4级，与空白对照组有显著性差异(P＜0.0001)，而给药组的IDD表现也比术后4周更为明显，处于3～4级，但与IDD-Saline组相比其退变程度也明显减缓(P＜0.05);2.在术后4周、8周，分别对大鼠Co8/9椎间盘进行组织学染色，IDD-Saline组术后8周的组织学评分较空白对照组显著增高(P＜0.0001);在PNS给药组，NP组织的退变和椎间盘结构的破环与IDD-Saline组相比明显更轻微，术后8周的组织学评分更低(P＜0.05)。 结论: 本研究揭示了“祛瘀生新”法理论指导下活血化瘀药三七的主要有效成分PNS对治疗腰椎间盘退变的分子生物学机制，结果显示PNS对治疗IDD总体疗效满意，在大鼠IDD模型中可改善椎间盘在影像学及组织学上的退变;在体外实验中发现PNS以治疗氧化应激造成的椎间盘损伤的“瘀”疗效为佳，可通过抑制自噬，减少NP细胞凋亡和ECM的降解，延缓IDD，且自噬可能经由Akt/mTOR信号通路调控;而PNS对于炎症刺激造成的椎间盘损伤的“瘀”尚未表现出积极作用。本研究得出的不同的结果恰好为中药的辨证施治的分子生物学机制提供了一种可能的解释，为以后深入研究奠定了基石。
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