摘要
研究背景及目的: 中风后脑血流量的减少和随之而来的缺氧会触发复杂的级联反应，从而导致细胞死亡和神经功能缺损。当前的治疗策略主要是神经保护和溶栓疗法，其目的是减少神经元的死亡和保护受损的细胞，但是两种疗法都不能再生新的神经元并修复受损大脑。脑损伤后神经发生的激活对于脑缺血后的再生医学具有重要意义，越来越多的研究关注于能够刺激不同阶段成人神经发生的药物。补阳还五汤(Buyanghuanwudecoction，BHD)是治疗“气虚血瘀”型中风的经典方剂。既往研究发现补阳还五汤可以通过调控钙信号、兴奋毒性、炎症反应等多种机制，对脑缺血损伤神经元、血管、神经胶质细胞、脑内微环境等多方面产生保护和改善作用。除了上述机制外，补阳还五汤还可以刺激缺血后海马和脑室下区的神经祖细胞增殖，通过调节轴突生长相关蛋白、改善突触可塑性促进缺血后轴突再生。研究发现，自噬也与神经细胞的存活和神经干细胞(neurolstemcells，NSCs)的分化息息相关。已有证据表明，补阳还五汤可以调节自噬保护糖氧剥夺/复氧（oxygenglucosedeprivation/reoxygenation，OGD/R）后的神经元存活。补阳还五汤的临床疗效已经被广泛认可，但是对神经损伤的修复和如何刺激神经再生的作用还不清楚。因此我们假设:有效剂量的补阳还五汤含药血清可以恢复糖氧剥夺后的神经干细胞损伤，并促进神经发生，自噬可能参与补阳还五汤调节NSCs的过程。研究选用体外糖氧剥夺/复氧模型模拟缺氧环境，从细胞实验和分子实验两部分出发探讨可能的机制。 研究内容及方法: 1.补阳还五汤含药血清抗缺氧模型的神经保护作用 从SD大鼠海马区分离培养原代神经干细胞，将细胞随机分为5组:常氧组、模型组、补阳还五汤低剂量组（5％含药血清）、补阳还五汤中剂量组（10％含药血清）、补阳还五汤高剂量组（20％含药血清）;通过光学显微镜观察细胞形态，利用免疫荧光鉴定NSCs及分化为神经元和星型胶质细胞的潜能;建立糖氧剥夺模型;CCK-8和LDH检测补阳还五汤的最佳量效关系及保护作用。 2.自噬在补阳还五汤促进神经干细胞的神经发生中的作用及机制 从SD大鼠海马区分离培养原代神经干细胞，将细胞随机分为5组:常氧组、模型组、补阳还五汤组、雷帕霉素组（Rapa）、自噬抑制剂3-Methyladenine（3-MA）联合补阳还五汤组。通过Western-blot技术检测自噬相关蛋白P62、Beclin-1、LC3B的表达情况;PI3K-AKT通路蛋白表达情况和β-catenin蛋白表达;ad-mCherry-GFP-LC3B腺病毒三标在共聚焦显微镜上标记自噬蛋白LC3B，检测自噬流;5-乙炔-2-脱氧尿苷(EdU)标记法检测NSCs增殖;免疫荧光法检测脑源性神经营养因子(BDNF)、β-微管蛋白-Ⅲ(βtubulinⅢ)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。 结果: 1.补阳还五汤抗神经干细胞糖氧剥夺损伤的神经保护作用: 初代神将干细胞接种12h后，光镜下观察可见大量细胞聚集体和均匀散落的细胞。培养4d后悬浮的细胞呈球状生长，大小不一，折光性好，边缘光滑。第3代的神经干细胞用神经干细胞巢蛋白Nestin抗体标记，呈阳性反应。经分化培养基诱导7d的第3代神经干用神经元标志物βtubulinⅢ和胶质细胞标志物GFAP进行细胞免疫荧光染色，呈现阳性反应。 与常氧组相比，造模2h后，神经干细胞存活率降低不显著（P＞0.05）;造模4h细胞存活率降低显著，（P＜0.05）;造模6h细胞存活率显著下降(P＜0.01)。 补阳还五汤量效关系显示:与常氧组相比，模型组神经干细胞细胞活力显著降低（P＜0.05）;与模型组相比，5％体积分数的含药血清没有起到明显的保护作用;10％含药血清与模型组相比，细胞活力略微提升（P＞0.05）;20％含药血清显著提高了细胞存活率(P＜0.01)。 乳酸脱氢酶漏出率结果显示:常氧组相比，模型组漏出率升高明显（P＜0.01）;与模型组相比，5％含药血清漏出率降低不明显(P＞0.05);10％含药血清漏出率下降明显，起到了一定的保护作用（P＜0.05）;20％含药血清漏出率显著下降(P＜0.05)。 2.补阳还五汤治疗缺血性中风的促神经再生作用及自噬在其中的作用机制: WB结果显示:与常氧组相比，糖氧剥夺后，LC3Ⅱ、Beclin1、P62没有统计意义;与模型组相比较，BHD组LC3Ⅱ、Beclin1显著上调(P＜0.05，P＜0.01)，P62表达下调（P＜0.01），自噬活性上调。加入自噬激动剂和抑制剂，与模型组相比，Rapa组LC3Ⅱ、Beclin1显著上调，与给药组趋势一致(P＜0.01，P＜0.01)，P62表达抑制（P＜0.01）;3-MA+BHD组LC3Ⅱ、Beclin1下调(P＜0.01，P＜0.01)，P62表达上调(P＜0.01)。 与常氧组相比，糖氧剥夺后，β-catenin蛋白表达没有统计差别;与模型组相比，BHD组β-catenin蛋白上调，Rapa组上调(P＜0.01，P＜0.01)，3-MA组没有差异。 与常氧组相比，糖氧剥夺后，P-PI3K下调，P-AKT变化不明显(P＜0.05，P＞0.05)，与模型组相比，BHD组P-PI3K下调，P-AKT下调，表明通路被抑制(P＜0.05，P＜0.01)。 Ad-mCherry-GFP-LC3B进一步验证了自噬通量，BHD组绿色荧光在酸性环境下淬灭呈现红色，Rapa组表现类似趋势，3-MA部分阻断自噬活性。 Edu增殖结果表明:与常氧组相比，模型组细胞Edu染色数量明显减少;与模型组相比，BHD及Rapa组显著提高了Edu阳性细胞数量;3-Ma+BHD组没有明显变化。 免疫荧光结果显示:与常氧组相比，模型组βtubulinⅢ和GFAP、BDNF阳性细胞数量减少;与模型组相比，BHD组阳性细胞数量增加，Rapa组阳性细胞数量增加，3-MA+BHD组阳性细胞数量减少。 结论: 1.糖氧剥夺/复氧会显著降低大鼠NSCs的细胞活力，与模型组比较，BHD明显改善了大鼠NSCs存活。 2.BHD可以诱导OGD后NSCs自噬小体的产生，增加LC3Ⅱ的形成和转运，使Beclin1表达增加而p62表达减少，Edu、βtubulinⅢ、GFAP和BDNF阳性细胞数显著增加。自噬激动剂Rapa起到了同样的保护和促进作用，自噬抑制剂3-MA可以部分阻断BHD的神经保护和分化能力。 3.BHD可能通过下调PI3K-AKT通路影响自噬活性，自噬和β-catenin之间的串扰可能是BHD保护NSCs并促进增殖、分化的原因。 4.糖氧剥夺后，BHD对NSCs的保护和神经发生作用可能有自噬的参与。 综上所述，BHD预保护可以通过上调自噬减少糖氧剥夺造成的大鼠NSCs损伤，促进增殖、分化。
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