摘要
目的: 1.明确铁死亡是否参与糖尿病性骨质疏松(DOP)的发病机制; 2.明确黄芩素在体内抑制铁死亡防治DOP的作用; 3.基于SLC7A11/GPX4轴探讨黄芩素在体外抑制BMSCs铁死亡的作用机制。 方法: 1.动物实验研究 (1)铁死亡在DOP发病中的作用 SpragueDawley(SD)大鼠随机分为三组:基线组，对照组和模型组。模型组大鼠给予高脂饲料喂养4周后，给予链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）（30mg/Kg体重）单次腹腔注射造模，建立2型糖尿病模型，测量大鼠体重、进水量和摄食量、空腹血糖(fastingbloodglucose，FBG)，8周后取材。检测指标: ①体重、进水量和摄食量1 比较对照组和模型组大鼠的体重、进水量和摄食量。 ②血糖及糖化血红蛋白 血糖仪检测大鼠尾静脉多个时间点FBG，以及血糖化血红蛋白(glycosylatedhemoglobin，GHbAc1)水平。 ③腰椎骨量 取大鼠腰椎腰1-3(L1-3)，用双能X线吸收法进行骨密度(bonemineraldensity,BMD)检测。 ④腰椎骨组织形态 大鼠L1-3椎体BMD测定后，分离L2椎体，进行苏木素-伊红(hematoxylineosin，HE)染色，观察组织形态学改变。 ⑤腰椎骨微细结构 大鼠L1-3椎体BMD测定后，分离L3椎体，用micro-CT进行骨微细结构扫描，获取相关参数。 ⑥骨生物力学 大鼠L1-3椎体BMD测定后，分离L1椎体，用万能材料试验机进行压缩试验;取大鼠股骨用万能材料试验机进行三点弯曲试验。分别获取相关参数。 ⑦氧化应激水平和铁离子水平 大鼠血液离心获取血清，测定血清总超氧化物歧化酶(totalsuperoxidedismutase，tSOD)活性;取大鼠腰椎骨组织，研磨后裂解获取组织裂解样品;分别用试剂盒检测组织丙二醛(malondialdehyde，MDA)和总铁离子水平。 ⑧铁死亡相关蛋白表达 取大鼠冻存腰椎骨组织，研磨后裂解获取总蛋白，Westem-blot检测COX2、VDAC2、FTH1、SLC7A11、GPX4蛋白的表达水平。 (2)黄芩素对大鼠DOP的防治作用 SD大鼠随机分为三组:空白对照组，模型组和黄芩素组。模型组和黄芩素组给予高脂饲料喂养4周后，给予STZ（30mg/Kg体重）单次腹腔注射造模，建立2型糖尿病模型。两组分别再分为2部分用于预防实验和治疗实验。 ①黄芩素对血糖的影响 检测大鼠尾静脉FBG;进行口服糖耐量测试(oralglucosetolerancetest，OGTT)，即空腹(0h)、0.5h、1h和2h血糖值;ELISA法检测血清GHbAc1水平。 ②黄芩素对骨量的影响 取大鼠L1-3，用双能X线吸收法进行BMD检测。 ③黄芩素对骨生物力学的影响 大鼠L1-3椎体BMD测定后，分离L1椎体，用万能材料试验机进行压缩试验;取大鼠股骨用万能材料试验机进行三点弯曲试验。分别获取相关参数。 ④黄芩素对骨微细结构的影响 大鼠L1-3椎体BMD测定后，分离L3椎体，用micro-CT进行骨微细结构扫描，重建分析，获取相关参数。 ⑤黄芩素对骨组织形态的影响 大鼠L1-3椎体BMD测定后，分离L2椎体，进行HE染色，观察组织形态学改变。 ⑥黄芩素对氧化应激的影响 血液离心后获取血清，测定血清总tSOD活性;取大鼠腰椎骨组织，研磨后裂解获取组织裂解样品，用试剂盒检测组织MDA水平。 ⑦黄芩素对成破骨因子的影响 ELISA法检测血清OPG、RAKNL、TRAP5b水平。 ⑧黄芩素对SLC7A11/GPX4轴蛋白表达的影响 取大鼠冻存腰椎骨组织，研磨后裂解获取总蛋白，Western-blot检测COX2、SLC7A11、GPX4蛋白的表达水平。 2.细胞实验研究 从3-4周龄SD大鼠股骨或胫骨提取骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenchymlstemcell，BMSCs)，培养传代，取P3-5进行实验。 (1)黄芩素和乙酰半胱氨酸对BMSCs增殖的影响 BMSCs种于96孔板，CCK-8法检测不同浓度黄芩素、乙酰半胱氨酸(NAC)下BMSCs在1、3、5、7天的增殖情况。 (2)Erastin诱导BMSCs脂质过氧化和铁死亡的作用 检测不同浓度Erastin下BMSCs产生MDA的水平;CCK-8检测不同浓度Erastin下BMSCs存活率（铁死亡情况）。 (3)黄芩素对Erastin下BMSCs脂质过氧化和细胞内铁离子水平的影响 检测黄芩素干预下BMSCsMDA和细胞内总铁离子水平。 (4)黄芩素对Erastin下BMSCs存活率的影响 CCK-8检测黄芩素干预下BMSCs存活率（铁死亡）。 (5)黄芩素对Erastin下BMSCs增殖的影响 CCK-8检测黄芩素干预下BMSCs在1、3、5天的增殖情况。 (6)黄芩素对Erastin下BMSCs成骨分化的影响ALP染色观察黄芩素干预下BMSCs成骨分化的情况。 (7)黄芩素对SLC7A11/GPX4轴蛋白表达的影响 Western-blot检测SLC7A11/GPX4轴表达。 结果: 1.动物实验研究 (1)铁死亡在DOP中的作用 ①大鼠STZ造模后，模型组多个时间点FBG均显著高于对照组(P＜0.01或P＜0.001)，体重显著低于对照组(P＜0.001)。 ②模型组腰椎BMD较对照组显著降低(P＜0.01)。 ③模型组腰椎骨组织形态发生显著改变，骨小梁数目减少、骨小梁厚度变薄，骨髓内脂肪显著增加。 ④模型组腰椎相对骨体积(BV/TV)、骨小梁厚度、骨小梁数量显著减小（分别P＜0.05、P＜0.01、P＜0.05）。 ⑤与基线组比较，对照组腰椎最大载荷、断裂载荷显著提升（均P＜0.01）;与对照组比较，模型组腰椎最大载荷、断裂载荷、弹性模量有较明显的降低趋势，股骨最大载荷显著降低(P＜0.05)。 ⑥模型组血清OPG水平显著降低(P＜0.05)，RANKL、OPG/RANKL有轻微降低趋势; ⑦模型组血清tSOD活性显著降低(P＜0.05);骨组织MDA和总铁离子水平显著升高（均P＜0.05）; ⑧模型组骨组织铁死亡相关蛋白COX2表达显著上调（P＜0.01），SLC7A11、GPX4、FTH1显著下调（分别P＜0.05、P＜0.05、P＜0.01）。 (2)黄芩素抑制铁死亡预防DOP ①STZ造模后，模型组和黄芩素组FBG显著高于空白对照组（均P＜0.001），模型组和黄芩素组差异无显著意义。 ②预防实验中:模型组腰椎BMD较空白对照组显著降低(P＜0.01)，黄芩素组显著高于模型组(P＜0.05)。治疗实验中:模型组BMD显著低于空的对照组(P＜0.05)，黄芩素组较空白对照组降低无统计学意义。 ③预防实验中:模型组腰椎最大载荷显著低于空白对照组(P＜0.01)、压缩位移显著高于空白对照组(P＜0.01)，黄芩素组腰椎最大载荷较空白对照组降低但无统计学意义。模型组和黄芩素组股骨最大应力较空白对照组显著下降(分别P＜0.001和P＜0.05)，黄芩素组股骨最大应力较模型组显著增加（P＜0.05）。治疗实验中:模型组腰椎最大载荷、断裂载荷均显著降低(分别P＜0.05和P＜0.05)，黄芩素组较模型组均无显著差异。模型组股骨最大载荷较空白对照组显著降低(P＜0.05)。 ④预防实验中:模型组腰椎BV/TV、Tb.N、Tb.Th较空白对照组显著降低(分别P＜0.05、P＜0.01、P＜0.01)、Tb.Sp显著增加(P＜0.01)，与模型组比较黄芩素组Tb.N显著增加（P＜0.05）、Tb.Sp显著降低(P＜0.05)。治疗实验中:模型组腰椎Tb.Th较空白对照组显著降低（P＜0.01）、Tb.Sp显著增加(P＜0.01)，黄芩素组较模型组无显著差异。 ⑤预防实验中:模型组腰椎骨小梁较空白对照组显著变细、黄芩素组骨小梁较模型组显著变粗。治疗实验中:模型组腰椎骨小梁较空白对照组显著变细、骨髓脂肪增多，黄芩素组骨组织形态较模型组无显著差别。 ⑥预防实验模型组、黄芩素组大鼠血清GHbAc1较空白对照组显著升高(P＜0.05和P＜0.01)。 ⑦预防实验模型组大鼠血清tSOD活性较空白对照组显著降低(P＜0.05)，黄芩素组tSOD较模型组显著提升(P＜0.001);模型组骨组织MDA水平较空白对照组显著增加（P＜0.01），黄芩素组MDA水平较模型组有明显降低趋势(P=0.054)。 ⑧预防实验模型组血清OPG较空白对照组显著降低(P＜0.01)，黄芩素组较模型组有轻微升高趋势。模型组RANKL较空白对照组有降低趋势，黄芩素组较模型组无显著差异。模型组TRAP5b较空白对照组有较大升高趋势，黄芩素组较模型组有较大降低趋势。 ⑨预防实验模型组COX2表达较空白对照组显著上调(P＜0.01)，黄芩素组较模型组有明显下调趋势;模型组GPX4较空白对照组显著下调(P＜0.01)，黄芩素组较模型组显著上调（P＜0.01）。 2.细胞实验研究 ①1、2、4μM黄芩素7天内对BMSCs增殖无影响，Day5时，在8、16μM浓度下，黄芩素可显著抑制BMSCs增殖（分别P＜0.01和P＜0.001）;Day7时，在16μM浓度下，黄芩素可显著抑制BMSCs增殖(P＜0.05)。1、2mMNAC在7天内对BMSCs增殖无影响;Day1时，8mMNAC可显著促进BMSCs增殖(P＜0.01)，16mM可显著抑制BMSCs增殖(P＜0.01);Day5时，8、16mMNAC均可显著抑制BMSCs增殖（分别P＜0.05和P＜0.001）;Day7时，4、8、16mMNAC均可显著抑制BMSCs增殖（分别P＜0.05、P＜0.01、P＜0.001）。 ②Erastin10、20、30、40μM下，BMSCsMDA水平显著增加（分别P＜0.05、P＜0.001、P＜0.0001、P＜0.0001），20、30、40μM下细胞存活率显著降低(分别P＜0.05、P＜0.05和P＜0.01)。 ③Erastin(20μM)下，黄芩素（4μM）和NAC(2mM)可显著降低BMSCsMDA水平（均P＜0.001）。 ④Erastin（20μM）下，4、8μM黄芩素使BMSCs存活率显著增加(分别P＜0.05和P＜0.001)。 ⑤Erastin(10μM)下，黄芩素(4μM)可显著改善BMSCsDay3、Day5的BMSCs增殖（分别P＜0.05、P＜0.01）。 ⑥Erastin(3μM)可显著抑制BMSCs成骨分化，黄芩素可一定程度改善Erastin下BMSCs成骨分化。 ⑦Erastin（10μM）显著下调SLC7A11和GPX4表达（分别P＜0.01和P＜0.01），黄芩素可显著上调Erastin干预下SLC7A11和GPX4的表达（分别P＜0.05和P＜0.001）。 结论: 体内研究发现:铁死亡参与DOP的发病机制;黄芩素可以有效预防DOP的发生，其机制与上调SLC7A11/GPX4轴抑制铁死亡有关。体外实验研究发现:黄芩素可以上调SLC7A11/GPX4轴抑制BMSCs铁死亡，促进BMSCs增殖和成骨分化。因此，黄芩素可预防DOP，其机制与上调SLC7A11/GPX4轴抑制BMSCs铁死亡有关。
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