摘要
目的: 广东省中医院肾内科刘旭生教授的经验方补脾益肾方，获得国家专利保护，并在大型多中心随机对照临床研究已证实延缓慢性肾脏病进展疗效确切。但是，补脾益肾方改善肾功能的分子机制目前尚不清楚，限制了我们进一步开发补脾益肾方在临床上的应用。本研究基于“肠肾轴”理论，观察补脾益肾方对5/6肾切除模型大鼠肾功能、肠道菌群、肠道屏障功能、血清代谢物的影响，联合肠道菌群和代谢组学及细胞实验，探讨补脾益肾方延缓慢性肾脏病进展的分子机制，为中药从脾肾论治慢性肾脏病提供新思路。 方法: 1.动物实验:本研究部分采用5/6肾切除大鼠作为慢性肾脏病模型，大鼠随机分为假手术组（Sham组）、5/6肾切除模型组（5/6Nx组）、低剂量补脾益肾方组(L-BYF组)和高剂量补脾益肾方组(H-BYF组)，Sham组和5/6Nx组予无菌水灌胃，L-BYF和H-BYF分别予低剂量和高剂量的补脾益肾方灌胃，每日1次，灌胃4周，收集血液、尿液、粪便、肾脏及结肠标本，行肾功能、尿蛋白定量、肾脏和肠道病理切片HE染色、肾脏病理切片Masson及PAS染色、western-blot法检测结肠组织紧密连接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-1、免疫因子IL-22及AhR信号通路分子AhR、CyP1A1、CyP1B1在肾脏组织中的表达水平、ELISA检测血清炎症因子IL-1B及IL-6水平、二代16SrDNA测序检测粪便肠道菌群、非靶向代谢组学筛选及分析差异代谢物。 2.细胞实验:本研究部分中，以硫酸吲哚酚(Indoxylsulfate，IS)刺激诱导人近端肾小管上皮细胞（HK-2）损伤为模型，予黄芪甲苷(AstragalosideⅣV，ASⅣV)干预，采用western-blot、流式细胞术、免疫荧光、siRNA瞬时转染等方法检测AhR在IS诱导HK-2细胞氧化损伤以及凋亡中的作用以及抑制AhR信号通路在补脾益肾方发挥肾保护的作用。 结果: 1.与Sham组大鼠相比，5/6Nx组大鼠的24h尿蛋白定量、血肌酐、尿素氮、IL-6和IL-1β有明显升高，差异具有显著性意义(P=0.000)。与5/6Nx组比较，H-BYF组大鼠的24h尿蛋白定量、血肌酐、尿素氮以及IL-6均显著下降(P＜0.05)，IL-β可见下降趋势，但不具有统计学差异(P＞0.05)。HE染色显示，在5/6Nx组大鼠中，肾组织出现明显肾小球结构紊乱，肾小管管腔增大、肾小管萎缩、肾间质纤维化，伴有单核淋巴细胞浸润;在L-BYF组和H-BYF组中，上述病理学损伤减轻，其中以H-BYF组中病理学改善最明显。Masson染色显示，Sham组未见纤维沉积;5/6Nx组有大量的胶原纤维沉积于肾间质中。与5/6Nx组比较，L-BYF组中大鼠肾脏组织中胶原纤维沉积减少，H-BYF组的肾脏胶原纤维沉积减少更为明显。PAS染色显示，Sham组未见明显病理改变;5/6Nx大鼠出现系膜细胞及机制增生、肾小管腔增大、间质纤维化、肾小管萎缩，伴有大量单核淋巴细胞浸润;与5/6Nx组相比，L-BYF组大鼠肾脏病理损伤减轻，H-BYF组大鼠肾损伤缓解更为明显。Western-blot定量结果显示:与Sham组比较，5/6Nx组大鼠的肾脏组织AhR、CyP1A1与CyP1B1的表达水平均显著升高（P＜0.05）;与5/6Nx组比较，H-BYF组的肾脏组织AhR、CyP1A1与CyP1B1的表达水平均显著下降（P＜0.05）。 2.结肠组织病理显示:Sham组大鼠的结肠黏膜组织紧密、炎症细胞较少;5/6Nx组大鼠的结肠组织中，粘膜层出现明显水肿，固有层组织疏松、炎症细胞浸润严重。与5/6Nx模型组相比，L-BYF组和H-BYF组大鼠粘膜层和固有层的水肿情况明显改善，粘膜层中炎性细胞的浸润减少，其中以H-BYF组最为明显。Western-blot定量结果显示:与Sham组比较，5/6Nx组大鼠的结肠组织ZO-1、Occludin、Claudin-1及IL-22表达均显著下降（P＜0.05）;与5/6Nx组比较，H-BYF组的ZO-1、Claudin-1及IL-22表达均显著升高(P＜0.05)，Occludin表达则呈升高趋势，不具有统计学意义。 3.肠道菌群分析结果显示，α-多样性方面，基于OTU水平，5/6Nx组的Shannon指数较H-BYF组高，Simpson指数较H-BYF组低，并具有统计学差异(P=0.0011和P=0.0006)。β-多样性分析方面，基于非加权的距离的PCoA，5/6Nx模型组大鼠与H-BYF组大鼠明显分开，聚成一簇，而L-BYF大鼠则介乎二者之间。物种组成分析方面，在门的水平上，各组大鼠肠道菌群均以拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门(Firmicutes)为主。在科与属的水平上，使用Lefse分析以筛选差异物种，结果显示:与5/6Nx组比较，H-BYF组大鼠粪便中Prevotella、Phascolarctobacterium和egamona的相对丰度升高，Clostridiaceae、Haioplasmataceae、icrococcaceae、Pseudomonadaceae的相对丰度降低。 4.代谢组学结果显示:基于非靶向代谢组学，PLS-DA分析显示H-BYF组与5/6Nx组各自成簇。在阳离子模式下，5/6Nx组和H-BYF组之间的差异代谢物总数为405种（293种上调及112种下调）;在阴离子模式下，5/6Nx组和H-BYF组之间的差异代谢物总数为195种(123种上调及72种下调)。基于KEGG数据库的差异代谢物的代谢途径富集分析确定了35个代谢途径，其中3个（酪氨酸与色氨酸生物合成、色氨酸代谢、色氨酸介导的炎症因子调节）与色氨酸有关。与5/6Nx组比较，色氨酸代谢的三个途径代谢物IS、犬尿喹啉酸与褪黑素在H-BYF组发生显著变化，IS和KA显著下降，褪黑素显著升高，均具有统计学意义（P＜0.05）。Western-blot定量结果显示，与Sham组大鼠比较，5/6Nx组大鼠的肾脏AhR、CyP1A1、CyP1B1表达明显升高，具有显著性差异（P＜0.05）;与5/6Nx组大鼠比较，H-BYF组大鼠肾脏AhR、CyP1A1、CyP1B1的表达水平均有升高，而H-BYF组与5/6Nx组之间具有显著性差异（P＜0.05）。 5.细胞实验:本研究以IS100ug/mL诱导HK-2细胞损伤为模型，以补脾益肾方的主要成分黄芪甲苷50ug/mL为干预药物，与Normal组比较，IS组中IS刺激细胞后HK-2细胞形态异常，ROS含量升高，线粒体膜电位下降，AhR信号通路分子包括AhR、CyP1A1和CyP1B1表达增加(P＜0.05)。与IS组比较，AhR-siRNA+IS组AhR表达减少，线粒体膜电位升高，ROS含量下降，细胞凋亡减少。与AhR-siRNA+IS组相比，AhR-siRNA+IS+ASIV组的细胞AhR表达被抑制，而细胞凋亡无进一步减少。分子对接模拟结果显示黄芪甲苷和AhR分子表面结合得较为紧密，黄芪甲苷结合到AhR的活性位点，与活性位点附近的TYP239、LEU253、ASN244、GLU243和HIS153五个氨基酸形成氢键而产生相互作用。 结论: 1.本研究中，证实补脾益肾方可降低5/6肾切除大鼠的血肌酐和尿素氮，降低蛋白尿水平，缓解肾脏病理损伤。 2.基于肠道菌群，研究中发现补脾益肾方调节肠道菌群，减少产毒素菌群等致病菌的相对丰度，增加益生菌的相对丰度，促进短链脂肪酸的产生，促进紧密连接蛋白和IL-22的表达，改善肠道屏障功能。 2.基于LC-MS/MS的非靶向代谢组学方法，KEGG富集通路分析提示色氨酸代谢为补脾益肾方改善肾功能的代谢通路之一，补脾益肾方调节色氨酸的代谢，抑制犬尿氨酸途径产生犬尿喹啉酸和吲哚途径产生硫酸吲哚酚，促进5-羟色胺途径产生褪黑素。同时，补脾益肾方抑制肾脏AhR、CyP1A1和CyP1B1的表达。 3.体外实验中，AhR的表达是硫酸吲哚酚致肾小管上皮细胞发生氧化应激的重要原因，黄芪甲苷作为补脾益肾方的主要成分，其发挥抑制氧化应激的作用是以AhR为作用靶点。因而补脾益肾方可能通过抑制AhR信号通路以发挥保护肾功能的作用。 4.补脾益肾方可能是通过调节肠道菌群，保护肠道屏障，调节色氨酸代谢，尿毒症毒素减少，抑制AhR信号通路，发挥肾保护作用，为中药从脾肾论治慢性肾脏病提供新思路。
NETL