摘要
研究背景 直肠脱垂(RectalProlapse，RP)是肛肠科的少见良性病，古代中医称“脱肛”。中医固脱疗法是其重要的治疗方式，具有疗效好、操作简单、痛苦小等优势。消痔灵是固脱剂的代表药物。本课题组长期采用消痔灵注射治疗直肠脱垂，获得了较好的疗效。 但消痔灵注射后存在一定的复发率，并成为治疗的难点。针对复发这一难题，本课题组曾探索性将双层四步注射（简称“双层四步”）改进为直肠周围间隙八步注射（简称“单层八步”），经过前期病例系列的观察，发现消痔灵单层八步注射可在一定程度上减少复发。因未与双层四步注射进行对比研究，其结果缺乏循证医学证据。同时，单靠改进注射方式以减少复发，并不足以解决问题。根据我们的经验，影响消痔灵注射治疗直肠脱垂复发的因素较多，但还没有一个量化工具对复发进行准确预测。因此，后续需要继续深入研究并找出影响复发的各种相关危险因素，建立临床预测模型，对复发概率进行量化评估，以便对高复发人群提前进行重点干预，制定个体化治疗方案。 注射方式作为影响复发的可能因素之一，还需进行深入探讨，即比较单层八步和双层四步注射的近远期疗效，进一步分析不同注射方式对治愈率、复发等方面的影响程度，以提供循证医学证据。 相对于临床研究，消痔灵注射治疗直肠脱垂的基础研究还较为落后，其作用机制至今尚未阐明。作为中医药研究的一个重要手段，整合药理学从分子、细胞、组织等多个层面上，解析了中药复方的分子生物网络和药理效应。将整合药理学的研究方法运用到阐释消痔灵注射治疗直肠脱垂的作用机制中，以探索其作用的关键靶点和效应途径。 研究目的 1.探讨消痔灵注射治疗直肠脱垂复发的影响因素，建立临床预测模型，客观评估其复发概率，重点加强对高复发人群的及时干预，提供个体化诊治方案以减少复发。 2.基于真实世界研究方法进行回顾性队列研究，比较作为复发影响因素之一的不同注射方式（单层八步与双层四步）的近期疗效和远期复发率，并利用倾向性评分匹配法均衡组间的混杂因素，为临床研究提供循证医学证据。 3.采用整合药理学的研究方法，探索消痔灵注射治疗直肠脱垂的潜在作用机制，为基础和临床研究提供理论指导。 研究方法 1.消痔灵注射治疗直肠脱垂复发的预测模型构建 以2009.1.1-2019.12.31期间行消痔灵注射的直肠脱垂患者为研究对象，均来源于中国中医科学院广安门医院肛肠科。根据诊断、纳排标准，最终入选150例。收集患者年龄、性别、体质指数、病程、脱垂长度、脱垂形状、分型分度、肛门括约肌功能、是否合并小肠脱垂、注射方式10个潜在影响因素，以及术后3月、6月、1年、2年、3年、5年、10年的随访数据。 采用IBMSPSS26.0统计软件对整个队列150例患者的基本信息进行描述，对复发组与未复发组患者的特征进行一般描述。采用GraphPadPrism8.0绘制整个队列的Kaplan-Meier生存曲线并进行生存分析。采用两种方法筛选影响因素，分别为Cox单因素和多因素法，以及随机生存森林方法，确定与复发相关的危险因素，并进行Cox比例风险假定检验，其中分类变量采用R3.6.3软件包survminer，绘制两组生存曲线（Kaplan-Meier法），判断曲线有无交叉，生存资料的统计分析采用survival软件包。利用Log-rank检验进行组间差异的比较，以P＜0.05认为在统计学上有显著差异。对于连续变量，利用Schoenfeld残差法判断有无线性相关。基于以上两种方法筛选出的复发影响因素，分别建立预测模型，其预测复发的能力差异经Time-dependentROC曲线下面积来评价比较，选择预测能力较好的模型，进一步采用R3.6.3软件的foreign包、survival包、rms包绘制列线图，可视化呈现预测模型，模型的校准度采用校准曲线检验。 2.消痔灵单层八步和双层四步注射治疗直肠脱垂的疗效比较 以2009.1.1-2019.12.31期间行消痔灵注射的直肠脱垂患者为研究对象，均来源于中国中医科学院广安门医院肛肠科。根据诊断、纳排标准，最终入选150例。收集患者年龄、性别、体质指数、病程、脱垂长度、脱垂形状、分型分度、肛门括约肌功能、是否合并小肠脱垂、术前症状总积分，消痔灵的浓度比例(1∶1、2∶1)及用量，并计算原液总量。记录术后并发症（尿潴留、便秘、腹泻）和不良事件（小腹坠痛、肛门坠胀、发热、肛门出血、直肠粘膜溃疡及坏死、前列腺炎）情况。收集术后3月、6月、1年、2年、3年、5年、10年的随访数据。将队列分为单层八步和双层四步两组。 两组间混杂因素采用倾向性评分匹配法(PSM)加以平衡，卡钳值设为0.2，PSM分析通过IBMSPSS24.0统计软件的PSM扩展程序实现。最终按1∶1匹配后的病例进行比较。近期疗效指标中，主要比较两组治愈率和总有效率，术后第1、3、7、15天的症状总积分。次要观察并发症和不良事件的发生情况、严重程度、处理及转归。远期疗效指标中，主要比较两组总复发率、累积无复发生存率及中位无复发生存时间。次要观察复发后脱垂长度、伴随症状及治疗情况。数据分析采用IBMSPSS26.0软件，均为双侧假设检验，其中检验水准设为α=0.05，P＜0.05认为统计学上有差异。计量资料分正态分布和非正态分布两种情况:前者使用均数±标准差表示，以独立样本t检验进行组间比较;后者用中位数/四分位数间距表示，Wilcoxon秩和检验被用于组间比较。频数/百分率用于表示计数资料的构成比，其比较则采用卡方检验。等级资料利用Wilcoxon秩和检验比较。采用GraphPadPrism8.0绘制PSM前后脱垂长度的小提琴图。利用R3.6.3软件的survminer包绘制两组的生存曲线，survival包对生存资料进行统计分析，比较组间的差异，采用Log-rank检验，P＜0.05认为具有统计学差异的水平。检验效能利用PASS15.0.1软件计算。 3.基于整合药理学探讨消痔灵固脱注射治疗直肠脱垂的作用机制 基于TCMIPV2.0（整合药理学平台）以预测消痔灵和直肠脱垂的靶标，然后构建核心靶标网络，筛选关键靶标，并进行GO基因功能分析以及KEGG通路富集分析，最后建立“药物-化学成分-核心靶标-关键通路-疾病”的多维网络图，揭示其潜在作用机制。 研究结果 1.消痔灵注射治疗直肠脱垂复发的预测模型构建 1.1随访结果及总体生存分析 随访过程中，累计死亡4例，累计失访35例（第二次和第三次随访后的失访累计例数）。复发79例(52.7％)，未复发71例(47.3％)。150例患者的无复发中位生存时间为60月(95％CI(46.5-73.5))。术后3月、6月、1年、2年、3年、5年、10年的累积无复发生存率分别为93.3％、87.3％、80.3％、68.2％、55.1％、38.9％、22.1％。 1.2整个队列的临床基线特征分析 入选患者的中位年龄为47岁（28.75-68.25岁）。包括81例男性，69例女性，男女比例1.17∶1。体质指数为23.66+3.54。10年以下的病程占57.3％，10-50年病程占40％，50年以上病程占2.7％。脱垂长度在6cm以下者占62.7％。圆柱形脱垂形状最多见，占64.7％。以Ⅱ型Ⅰ度、Ⅱ型Ⅱ度脱垂占比更高(70％)。约一半的患者肛门括约肌功能减弱，肛门括约肌无收缩力的患者占16％。伴随小肠脱垂的患者比例稍高，占52％。消痔灵原液低剂量与中高剂量所占比例各约一半。行单层八步注射84例，双层四步注射66例。 1.3复发组与未复发组患者临床基线特征比较 与未复发组相比，复发组患者中老年居多，合并小肠脱垂者占多数，采用双层四步注射占比更大，差异具有显著的统计学意义(P＜0.01)。复发组大多数患者病程在10年以上，差异具有统计学意义(P＜0.05)。余两组性别、体质指数、脱垂长度、脱垂形状、分型分度、肛门括约肌功能及女性患者分娩与未分娩的比较，差异均没有统计学意义(P＞0.05)。 1.4筛选危险因素并建立复发预测模型 1.4.1Cox单因素与多因素方法 结局变量为注射后是否复发，在单因素分析中，把影响因素（P≤0.1）纳入Cox多因素中，以输入法的方式分析，影响复发的危险因素经筛选并符合Cox比例风险假定检验，最终如下:分型分度之Ⅱ型Ⅲ度（X1，P=0.000＜0.01），肛门括约肌无力(X2，P=0.032＜0.05)，小肠脱垂（X3，P=0.018＜0.05），注射方式（单层八步，X4，P=0.016＜0.05）。建立的预测模型为:h(t，X)=h0(t)exp(1.344*X1+0.730*X2+0.610*X3-0.592*X4)。 1.4.2随机生存森林方法 结局变量为注射后是否复发，影响复发的危险因素经筛选并符合Cox比例风险假定检验，最终如下:分型分度之Ⅱ型Ⅱ度(X1，β=0.763，P=0.069＞0.05)、分型分度之Ⅱ型Ⅲ度（X1，β=1.278，P=0.001＜0.01），肛门括约肌功能减弱(X2，β=0.558，P=0.054＞0.05），肛门括约肌无力(X2，β=0.703，P=0.037＜0.05)，小肠脱垂(X3，P=0.010＜0.05)，脱垂长度（X4，P=0.158＞0.05），年龄(X5，P=0.027＜0.05），注射方式（单层八步，X6，P=0.009＜0.05）。建立的预测模型为:h(t,X)=h0(t)exp(0.763/1.278*X1+0.558/0.703*X2+0.648*X3+0.058*X4+0.012*X5-0.675*X6) 1.5两种复发预测模型性能评价 根据Time-dependentROC曲线下面积AUC(t)显示，与Cox单、多因素筛选法（4个危险因素）相比，随机生存森林筛选法（6个危险因素）建立的Cox预测模型，在术后每个随访节点的AUC值均高于前者，其均值也大于前者(0.803versus0.773)。 1.6绘制列线图预测模型 绘制列线图，可视化呈现由随机生存森林方法筛选的危险因素所建立的预测模型。 1.7校准曲线评价列线图预测模型的校准度 由校准曲线可知，列线图预测模型在注射后3月、6月、1年、2年、3年、5年、10年的预测复发概率与实际复发概率基本一致。 2.消痔灵单层八步和双层四步注射治疗直肠脱垂的疗效比较 2.1单层八步组与双层四步组PSM前基线资料情况 PSM前，两组间性别、年龄、体质指数、病程、分型分度、肛门括约肌功能、脱垂形状、小肠脱垂及术前症状总积分的差异均在统计学上无意义（P＞0.05），但两组脱垂长度差异则在统计学上有意义(P＜0.05)。脱垂长度作为重要的影响因素，需采取PSM法平衡两组间的这一差异。 2.2单层八步组与双层四步组PSM后基线资料情况 PSM后，单层八步组中有35例未能匹配，双层四步组中有17例未能匹配，均被排除，最终两组均纳入49例，组间达到平衡并具有可比性。 2.3单层八步组与双层四步组PSM后近期疗效比较 单层八步组治愈率高于双层四步组，差异具有统计学的意义(P＜0.05)，两组间总有效率的差异，则无统计学意义（P＞0.05）。注射术后，两组间第1、3、7、15天的症状总积分比较中，在术后第1天，其差异并没有统计学的意义(P＞0.05)，在术后第3、7、15天，单层八步组症状总积分均低于双层四步组，脱垂症状改善更好，差异均有统计学意义（P＜0.05）。 两组并发症的发生等级均为轻度。单层八步组共发生3例(6.1％)，其中1例尿潴留，1例便秘。双层四步组共发生6例(12.2％)，其中2例尿潴留，3例便秘，1例腹泻。两组间的差异均在统计学上无意义(P＞0.05)。两组发生的不良事件均为轻度，总发生率具有差异(P＜0.05)。单层八步组共发生14例(28.6％)，包括小腹坠痛8例，肛门坠胀3例，发热1例，肛门出血1例，血压、心率下降1例，无直肠粘膜溃疡、坏死和前列腺炎发生。双层四步组共发生6例(16.3％)，包括小腹坠痛1例，肛门坠胀1例，发热1例，肛门出血2例，直肠粘膜溃疡1例，无前列腺炎及血压、心率下降发生。其中，单层八步组发生小腹坠痛明显多于双层四步组，差异具有统计学意义(P＜0.05)。余肛门坠胀，发热，肛门出血，直肠粘膜溃疡、坏死，前列腺炎，血压、心率下降的比较，两组间的差异，在统计学上均无意义（P＞0.05）。单层八步组出现不明原因血压、心率下降1例，经积极处理后恢复正常，未遗留后遗症。双层四步组出现1例便血后，肠壁柱状坏死形成窦道，经保守治疗1月后好转出院。 2.4单层八步组与双层四步组PSM后远期疗效比较 单层八步组的总复发率为51.0％(25/49)，无复发中位生存时间为60月(95％CI(45.2-74.8))。术后3月、6月、1年、2年、3年、5年的累积无复发生存率分别为95.9％、91.8％、87.6％、73.4％、58.2％、31.0％。双层四步组的总复发率为65.3％(32/49)。无复发中位生存时间为24月(95％CI(11.4-36.6))。术后3月、6月、1年、2年、3年、5年的累积无复发生存率分别为87.8％、79.6％、66.7％、49.4％、38.4％、25.8％。两组总复发率无差异(P=0.152)。单层八步组累积无复发生存率高于双层四步组，其差异在统计学上具有意义(P＜0.05)，无复发中位生存时间更长（60月VS24月）。 单层八步组复发25例，其中13例男性、12例女性，最大年龄为89岁，最小15岁，60岁以上者10例，病程10年以上者13例，合并小肠脱垂者16例。双层四步组复发32例，其中16例男性、16例女性，最大年龄为89岁，最小17岁，60岁以上者有13例，病程10年以上者有18例，合并小肠脱垂者16例。两组复发患者脱垂长度的比较，单层八步组短于双层四步组，差异具有统计学意义(P＜0.05)。两组发生的肛门坠胀、肛门失禁和便秘差异均无统计学意义(P＞0.05)。单层八步组有13例复发后继续来本院治疗，其中8例再次行单层八步注射，1例行吻合器痔上粘膜环切术，1例行直肠脱垂悬吊术（开腹），1例行直肠脱垂悬吊术（腹腔镜），1例行经肛直肠乙状结肠部分切除术，1例行肛门环缩术联合外括约肌折叠术。双层四步组有11例复发后继续来本院治疗，其中1例再次行双层四步注射，4例行单层八步注射，1例行吻合器痔上粘膜环切术，1例行直肠脱垂悬吊术（开腹），2例行直肠脱垂悬吊术（腹腔镜）。1例行单层八步注射联合自动痔疮套扎术。1例第二次行单层八步注射后再次复发，第三次予行直肠脱垂悬吊术（腹腔镜）。 3.基于整合药理学探讨消痔灵固脱注射治疗直肠脱垂的作用机制 通过TCMIPV2.0，设置药物相似性阈值≥0.6，去除重复靶标后，共获得消痔灵有效成分鞣酸的304个药物靶标，直肠脱垂靶标55个，构建核心靶标网络，筛选出6个药物作用的关键靶标(NFKB2、IKBKB、CHUK、NFKB1、NFKBIA、AKT1)。所参与的生物学过程主要包括:细胞周期阻滞、转录正调控DNA模板、蛋白质磷酸化等。KEGG通路富集分析显示，获得的信号通路有6条与NF-κB信号通路相关，分别为RIP-mediatedNF-κBactivationviaZBP1、TRAF6mediatedNF-κBactivation、TAK1activatesNF-κBbyphosphorylationandactivationofIKKscomplex、NF-κBisactivatedandsignalssurvival、ActivationofNF-kappaBinBcells、FCERImediatedNF-κBactivation。 研究结论 1.消痔灵注射治疗直肠脱垂复发的预测模型构建 筛选出消痔灵注射治疗直肠脱垂复发的影响因素并建立临床预测模型。以是否复发作为结局变量，并考虑未复发时间与复发结局的关系，采用两种方法:Cox单因素、多因素法和随机生存森林法，筛选复发影响因素并建立预测模型，由后者所建立的Cox比例风险模型对复发的预测性能更好。进一步构建了注射术后3月、6月、1年、2年、3年、5年、10年复发概率的列线图预测模型进行可视化呈现。其中年龄、分型分度、肛门括约肌功能、脱垂长度、小肠脱垂得分越高，则术后复发的概率越大。采用单层八步注射的复发概率低于双层四步注射。利用校准曲线验证后，显示列线图预测模型预测复发概率与实际复发概率基本一致。今后需不断扩大样本量并纳入更多影响因素（如影像学、组学等）进行前瞻性研究，进一步完善初步建立的预测模型，并利用外部队列数据验证，以便实际运用于临床，提高医师临床决策能力。 2.消痔灵单层八步和双层四步注射治疗直肠脱垂的疗效比较 单层八步组的近期治愈率高于双层四步组，术后第3、7、15天症状总积分低于后者，脱垂症状改善更好。两组的近期总有效率相当，均未出现严重的并发症和不良事件。远期疗效中，两组总复发率无差异，单层八步组比双层四步组累积无复发生存率更高，无复发中位生存时间更长，复发患者的脱垂长度更短。可推荐将单层八步注射作为注射疗法的首选术式。 3.基于整合药理学探讨消痔灵固脱注射治疗直肠脱垂的作用机制 通过整合药理学研究，获得消痔灵注射治疗直肠脱垂的关键作用靶点有NFKB2、IKBKB、CHUK、NFKB1、NFKBIA、AKT1，参与的信号通路中，与6条NF-κB信号通路相关，推测NF-κB信号通路的激活是消痔灵注射产生作用的重要环节。这为今后体内外实验验证奠定了一定的理论基础，对临床研究也具有重要的指导意义。
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