摘要
H9N2亚型禽流感病毒自1992年在我国首次分离以来，逐渐在我国广泛传播并呈地方流行性。疫苗免疫是预防H9N2亚型禽流感最主要的措施，表面糖蛋白血凝素(HA)是流感病毒主要的保护性抗原和疫苗的主要组成，在流感病毒感染过程中介导病毒入侵宿主细胞和病毒囊膜与细胞膜融合。近年来，H9N2亚型禽流感病毒在我国分离率上升，而且在炎热的夏季也能分离到，不同于以往的明显冬春季节分离率高的分布特点，可能跟病毒对热的稳定性增强有关。热稳定性和酸稳定性是流感病毒的重要生物学特性之一，对病毒的致病性、免疫原性、复制能力等都具有重要影响，但是目前这方面的研究较少。已经有研究尝试对HA蛋白进行修饰改变流感病毒疫苗株的HA稳定性和免疫原性。本研究挑选不同年代H9N2分离株，进行热稳定性和酸稳定性分析，并对影响毒株稳定性的关键区域和氨基酸位点及其对疫苗免疫原性的影响进行分析。 1.H9N2亚型禽流感病毒分离株HA稳定性研究 前期流行病学监测过程中发现，与以往毒株相比，H9N2亚型禽流感病毒分离株无明显季节性，夏季也可以分离到，分离株对热的稳定性增强。因此我们根据H9N2病毒的分离时间和遗传分布不同挑选了17株病毒，测定其对热和酸的稳定性。17株病毒中有6株热稳定型、9株中等稳定型和2株热不稳定型的毒株，6株热稳定型毒株中有5株为2012年以后的毒株，而热不稳定性毒株均属于2012年以前毒株;毒株酸稳定性无明显时间分布特点，但是部分毒株酸稳定性和热稳定性一致，如热、酸均稳定的毒株有AH463、FJ1802和C1，均不稳的毒株有5F2和SQ68。根据实验结果挑选了AH463和5F2为稳定性差异分析的模式病毒，分别构建它们的HA、NA质粒，并以前期构建的H9N2病毒AH320（6个内部基因）反向遗传平台为基础，分别单替换或双替换HA和NA基因，构建重组病毒。重组病毒稳定性实验结果表明病毒稳定性主要受HA基因影响。随后进一步构建AH320和5F2的HA1、HA2互换的嵌合型质粒pHA-AH320HA1+5F2HA2、pHA-5F2HA1+AH320HA2，AH320提供其余7个片段(PB2、PB1、PA、NA、NP、M、NS)，转染后拯救重组病毒。替换5F2HA1后重组病毒的热稳定性和酸稳定性与5F2毒株一致，而替换HA2后稳定性与母本病毒AH320一致，说明影响病毒稳定性的主要基因区域为HA1。同时我们将5F2和AH463的HA1、HA2进行互换，构建成重组嵌合质粒pHA-5F2HA1+AH463HA2、pHA-AH463HA1+5F2HA2，AH320提供其余7个片段(PB2、PBI、PA、NA、NP、M、NS)构建重组病毒。稳定性实验结果进一步证明影响病毒热和酸稳定性的关键区域位于HA1。 2.H9N2亚型禽流感病毒HA稳定性关键氨基酸位点分析及其对疫苗候选株免疫原性的影响 为了探究影响病毒稳定的氨基酸位点，我们从NCBI下载了2010以来所有H9N2的HA序列，用treesub软件绘制进化树，分析氨基酸变异;同时分析不同稳定性毒株的HA序列及其差异氨基酸位点。根据位点分析结果，最后挑选两种分析结果中HA1上氨基酸位点差异重合的6个位点（从稳定到不稳定）:L79S、A138V、Q156R、T163I、K246R、D248N（H3计数）。在疫苗候选株AH463HA质粒上分别引入上述6个位点的突变，与AH463NA质粒、AH3206个内部基因质粒转染后拯救点突变病毒，稳定性实验结果表明HA发生A138V点突变(rAH320-AH463-A138V)会降低原毒株的热稳定性和酸稳定性，其他点突变没有引起明显改变，说明138位氨基酸是影响病毒HA稳定性的关键氨基酸位点。A138V突变使AH463在CEF和MDCK的复制水平下降，并显著降低疫苗候选株AH463的免疫原性，免疫后1-3周，HI抗体水平下降4-7.5log2（16-180倍）。因此病毒HA稳定性改变对病毒免疫原性和复制能力会产生重要影响，但具体机制还需进一步探究。 综上所述，本研究对不同年代H9N2亚型禽流感病毒分离株的热稳定性和酸稳定性进行分析，稳定性差异的影响主要是HA1，并且A138V突变是影响病毒稳定性的关键氨基酸位点，同时影响病毒在体外的复制水平以及疫苗的免疫原性。
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