摘要
团队前期建立了SMA患者来源的多能诱导干细胞(inducedPluripotentStemCells,iPSCs)培养及定向分化获得运动神经元的体系，同时具有smn-/-，SMN22TG/0和SMA-Δ7两种小鼠模型。本研究利用SMN2minigene的定向突变(A-G)快速筛选能提高SMN2基因7号外显子纳入剪接的有效位点；并利用ABE编辑系统在HEK293T细胞，SMA-I型小鼠来源的胚胎干细胞(mouseembryonicstemcell,mESC)和SMA-I型患者来源的iPSC模型上筛选内源性有效编辑位点及确定腺嘌呤碱基编辑工具；在SMA-iPSC和修复后的(SplicingCorrected)SC-SMA-iPSC中验证SMN-FL转录本水平、SMN蛋白表达量、运动神经元分化、SMN蛋白抗凋亡能力和SMN蛋白参与体外snRNP组装能力的改善情况；并初步建立SMA及SC-SMA分化来源的脊髓前角类器官。 方法： 1.构建pSMN1，pSMN2及pSMN2-minigene-Mut定向突变(AtoG)质粒，在HEK293T中过表达，RT-PCR和qPCR检测定向突变对纳入7号外显子剪接的SMN-FLmRNA水平的提高情况。 2.针对SMN2的外显子剪接沉默子设计sgRNA，构建并比较ABE、ABEmaxF148A、miniABEmax及miniABEmaxV82G系统在HEK293T细胞、SMA-I-mESC和SMA-iPSC中不同编辑器、不同编辑位点的编辑效率及编辑后氨基酸变化情况，最终确定编辑位点及编辑工具。 3.采用miniABEmax联合sgRNA6编辑SMA-iPSC细胞获得SC-SMA-iPSC单克隆细胞株，从SMN-FL转录本、SMN蛋白表达量、定向分化运动神经元以及SMN蛋白抗凋亡能力等方面评估编辑后SMN蛋白功能改善情况；验证miniABEmax对有丝分裂后的运动神经元前体及SMA-Δ7小鼠皮层神经元编辑的有效性。 4.为确保编辑后不改变SMN蛋白氨基酸序列，进一步在SMN2基因3’UTR区域筛选有效编辑位点，并在修复后的SC-SMA单克隆细胞株中验证SMN-FL转录本水平、SMN蛋白表达量及SMN蛋白参与体外snRNP组装能力的改善，并初步建立SMA及SC-SMA分化来源的脊髓前角类器官模型。 结果： 1.在pSMN2-minigene-Mut定向突变筛选中获得Exon7上13个能明显提高SMN27号外显子纳入剪接的位点，在3’splicingsiteofE8上有一个有效编辑位点。 2.针对SMN2的外显子剪接沉默子，4种腺嘌呤单碱基编辑工具在3种细胞类型对内源性SMN2编辑后，综合考虑编辑效率、编辑位点是否改变氨基酸序列及RNA脱靶等因素，最终确定miniABEmax联合sgRNA6开展后续实验。 3.采用miniABEmax-sgRNA6获得SC-SMAA36GA38G和SC-SMAA36G单克隆细胞株，修复后的单克隆细胞株的SMN-FLmRNA水平、SMN蛋白表达量、SMN蛋白抗凋亡能力均较SMA本身显著提高，与WT基本持平甚至超过。miniABEmax联合sgRNA6在体外分化的有丝分裂后的SMA运动神经元前体细胞和SMA-Δ7小鼠皮层神经元均能有效编辑。 4.在SMN2基因的3’UTR区域获得一个有效编辑位点，并采用miniABEmax-sgRNA35获得了SC-SMA-E8A-10G单克隆细胞株；该sgRNA编辑完全不影响SMN蛋白的氨基酸序列，且SMN-FLmRNA水平、SMN蛋白表达量均高于SMA本身，与WT水平基本持平甚至超过；修复后的SC-SMA体外snRNP组装能力与WT基本一致；采用新的方案分化获得了SMA及SC-SMA来源的脊髓前角类器官模型。 结论： 优化版本的腺嘌呤单碱基编辑系统(miniABEmax)在内源性SMN2基因中，通过单个或多个碱基编辑Exon7-ESSB和3’splicingsiteofExon8获得多株SMA-I型剪接修复的iPS细胞株，且均能提高SMN2基因7号外显子的纳入剪接，使得SMN-FL转录本和SMN蛋白的表达量增高，通过体外分化运动神经元抗凋亡实验和体外snRNP组装实验证实表达增高的SMN蛋白能发挥正常功能，初步建立脊髓前角类器官模型。综合多方面因素比较，以E8A-10G位点为最优选，可作为后续小鼠成体实验的治疗靶点。
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