摘要
目的 有机阴离子转运多肽1B3（OrganicAnionTransportingPolypeptide，OATP1B3）属于人体有机阴离子转运多肽家族的成员之一，其主要分布于肝细胞基底侧，是重要的跨膜摄取转运体。OATP1B3的表达水平和功能不仅与药物在肝细胞内的摄取、分布有关，与多种疾病的发生发展都有关系。本研究旨在研究OATP1B3编码基因SLCO1B3的基因调控机制，进一步检测OATP1B3蛋白转运功能，为深入了解肝脏转运体对药物的摄取和分布，保证临床用药的有效性和安全性提供实验依据。 方法 我们首先构建SLCO1B3基因启动子全长及各分段报告基因重组载体，通过双荧光素酶报告实验分析出SLCO1B3基因启动子的关键活性区域；然后通过生物信息学技术预测潜在的转录因子结合位点；通过双荧光素酶报告基因实验、EMSA、ChIP实验验证转录因子与SLCO1B3基因启动子结合位点的特异结合；通过构建转录因子的过表达载体，化学合成siRNAs沉默基因表达，用Westernblot和realtimeRT-PCR实验检测了SLCO1B3的mRNA水平和蛋白表达水平，验证转录因子整体水平对SLCO1B3/OATP1B3的影响。 在确定c-jun调控SLCO1B3的转录表达后，由于c-jun需要被磷酸化激活才能发挥其调控作用，我们进一步用过表达载体，磷酸化激活剂和抑制剂处理细胞，Westernblot检测c-jun，p-cjun和OATP1B3蛋白的表达水平。布洛芬被报道可以促进c-jun磷酸化，我们进一步用布洛芬处理细胞，研究布洛芬是否可以通过促进c-jun磷酸化调控OATP1B3蛋白的表达，进而影响OATP1B3摄取转运功能（以OATP1B3特异底物头孢氨苄为检测对象）。使用CCK-8法检测布洛芬和头孢氨苄对HepG2和Huh7细胞的半数抑制浓度（IC50），根据布洛芬和头孢氨苄IC50和临床正常用药量，选取合适浓度的布洛芬和/或头孢氨苄处理细胞，通过Westernblot方法检测OATP1B3蛋白的表达，进一步用高效液相色谱-质谱联用技术检测细胞OATP1B3的摄取功能。 结果 1、双荧光素酶报告基因实验确定了SLCO1B3基因启动子的关键区域-198nt~+40nt。 2、生物信息学分析预测-198nt~+40nt区域存在c-jun和HNF1α特异性结合位点。 3、EMSA实验证实了转录因子c-jun可在体外特异结合于SLCO1B3基因启动子特定识别序列，HNF1α在体外不能特异结合SLCO1B3启动子特定识别序列。 4、ChIP实验证实了c-jun可以与SLCO1B3基因启动子特定序列存在体内相互作用，而HNF1α未检测到与SLCO1B3启动子特定序列在体内的相互作用。 5、双荧光素酶报告基因实验证实过表达c-jun使SLCO1B3基因启动子活性增加；相反地，沉默内源性c-jun使SLCO1B3基因启动子活性下降。 6、RealtimeRT-PCR及Westernblot实验证实过表达c-jun使SLCO1B3基因mRNA水平增高，OATP1B3蛋白表达上调；相反地，沉默内源性c-jun使SLCO1B3基因mRNA水平下降，OATP1B3蛋白表达下调。c-jun磷酸化增加可显著上调OATP1B3蛋白表达水平。 7、高效液相色谱-质谱联用实验证实布洛芬可促进细胞内c-jun磷酸化，增加OATP1B3蛋白表达，使细胞对OATP1B3特异底物头孢氨苄的摄取增加。 结论 1、通过构建SLCO1B3基因启动子全长及各分段报告基因重组载体，证实了SLCO1B3启动子-198nt~+40nt是启动子调控的关键区域。 2、转录因子c-jun可以与SLCO1B3启动子-198nt~+40nt区域的特定结合序列在体内外特异结合，c-jun磷酸化可显著上调OATP1B3蛋白表达水平，增强OATP1B3的转运功能。
NETL