摘要
【目的】： 特发性肺纤维化（IPF）是一种原因不明的慢性，进行性和纤维化的肺部疾病。其发病率呈逐年上升趋势，无特效药，其预后极差，严重影响患者的生存质量。IPF好发于老年人，有研究认为机体衰老是IPF的重要危险因素之一。因此，我们探索IPF与衰老相关的发病机制尤为重要。NAD（+）依赖的去乙酰化酶Sirtuins参与了衰老的过程，也在纤维化中起重要作用。但是Sirt7与IPF发生发展的关系，迄今国内外报道较少。有研究表明IPF患者的原代肺成纤维细胞中Sirt7的水平显著下降。因此，我们推测Sirt7可作为治疗IPF的新靶点。此外，EMT过程密切参与了IPF发生发展。因此，本课题将利用观察Sirt7在BLM诱导的肺纤维化发展的表达情况；过表达Sirt7表达水平探讨对肺上皮细胞纤维化发生发展中EMT的影响；进一步明确Sirt7是否通过TGF-β1/Smad信号通路来调控IPF发生发展的EMT。该研究进一步揭示IPF发病的分子机制，为IPF的防治提供新思路。 【方法】： 1.利用博来霉素（BLM）构建C57BL/6小鼠肺纤维化模型，随机把小鼠分为正常对照组、BLM模型组包括BLM分别处理7天、14天和28天组3组。小鼠进行腹腔注射麻醉，将BLM（对照组为生理盐水）5mg/kg注入气管内。3-4h后观察小鼠复苏情况。造模完成后分别于7、14和28天处死小鼠。留取小鼠肺组织标本。 2.小鼠一般状态：观察各组小鼠一般状态，包括体重、活动情况、毛发光泽度、精神状态、进食饮水情况、呼吸情况、发绀情况。 3.小鼠肺组织病理学改变：取各组小鼠右肺组织进行HE染色和Masson染色，光学显微镜观察右肺的病理学变化及胶原沉积情况。 4.小鼠肺组织中羟脯氨酸（HYP）含量测定。 5.WesternBlot检测各组小鼠肺组织中Sirt7、E-cadherin、α-SMA；TGF-β1、Smad3等蛋白的表达水平，比较分析小鼠肺组织中各组蛋白表达差异。 6.Beas-2b正常人肺上皮细胞用完全培养基培养于培养瓶中，先用WesternBlot实验检测α-SMA来确定博来霉素的最佳浓度；然后用最佳作用浓度的博来霉素来干预细胞，提取总蛋白检测E-cadherin、α-SMA蛋白的变化，确定最佳作用时间。 7.将细胞消化接种于6孔板后，用过表达Sirt7质粒去干预细胞后，加入BLM作用，提取细胞总蛋白检测E-cadherin、α-SMA、TGF-β1和Smad3的表达水平变化。 【结果】： 1.与正常对照组相比，各BLM模型组随造模时间延长饮食、摄水逐渐变差，活动减少，毛发逐渐干枯，体重下降，最终呼吸急促，甚至死亡。 2.与正常对照组相比，各BLM模型组小鼠肺组织HE和Masson染色结果显示第7天主要表现为炎性细胞浸润，14天胶原纤维沉积急剧增加，到第28天呈较典型的肺间质纤维化。 3.与正常对照组相比，各BLM模型组小鼠提取肺组织总蛋白WesternBlot检测EMT表型α-SMA表达上升和E-cadherin表达降低。并且Sirt7蛋白表达下降。TGF-β1/Smad3信号通路的蛋白表达水平上升。 4.细胞实验中，BLM诱导的肺上皮细胞中，Sirt7表达水平下降。过表达Sirt7质粒转染细胞，WB结果显示过表达Sirt7可以拮抗肺上皮细胞EMT的发生。 5.细胞实验中，过表达Sirt7质粒转染肺上皮细胞，BLM诱导后，WB结果显示过表达Sirt7可以拮抗TGF-β1/Smad3信号通路来抑制肺纤维化EMT的发生。 【结论】： 1.Sirt7在BLM诱导的小鼠肺纤维化模型和细胞模型中表达减少； 2.Sirt7参与了BLM诱导的小鼠肺纤维化模型和细胞模型中EMT的发生。 3.Sirt7通过抑制TGF-β1/Smad3信号途径诱导的肺纤维化中EMT的发生。
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