摘要
维氏气单胞菌（Aeromonasveronii）是一种可以感染人、兽及水生动物的共患病原菌，该菌不仅严重威胁鲤鱼等多种水生动物的健康，而且还可以导致人类及哺乳动物发生多种疾病，如坏死性脑膜炎、痢疾及败血症等。主要黏附素Aha1是外膜蛋白的主要成分之一，免疫原性较强，在疫苗开发中具有良好前景。但口服疫苗需要大量抗原刺激机体产生较高的免疫应答水平，黏膜免疫佐剂可以刺激全身和局部黏膜免疫应答，提高免疫效果。霍乱毒素B亚单位（choleratoxinBsubunit,CTB）和大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位（EnterotoxigenicEscherichiacoliBsubunit,LTB）作为一种常见的黏膜免疫佐剂，其具有良好的发展前景。 本研究以A.veroniiTH0426株aha1为目的基因，将其分别与CTB、LTB基因融合，并以Lactobacilluscasei为抗原递呈载体，分别构建3株锚定型重组乳酸菌（LC-pPG-Aha1、LC-pPG-Aha1-CTB和LC-pPG-Aha1-LTB），采用Westernblot和间接免疫荧光方法对蛋白的表达情况进行验证。结果显示，分别扩增出1038bpaha1基因、1449bpAha1-CTB融合基因和1383bpAha1-LTB融合基因，3株重组乳酸菌的蛋白大小分别为44kDa、57kDa和59kDa，经间接免疫荧光检测目的蛋白能锚定于菌体表面。遗传稳定性结果显示3株重组乳酸菌稳定性良好。 为评价以上3株重组乳酸菌的免疫效果，本研究将重组乳酸菌经乳糖诱导后包被颗粒饲料口服免疫鲤鱼，每次免疫3d，免疫周期间隔14d，共计免疫3次，采集免疫前0d和免疫后7、14、21、28、35及42d鲤鱼血清及各组织样品，通过ELISA方法检测血清中特异性IgM水平及ACP、AKP、SOD、LYS、C3、C4和Lectin酶活性，并通过qRT-PCR方法检测各组织中IL-10、IL-1β、TNF-α、IgZ1及IgZ2细胞因子水平；采集免疫后1、3、7、12及18d鲤鱼肠道组织进行肠道定植检测；免疫结束第5d后进行攻毒试验检测保护效果。结果显示，3株重组乳酸菌均能提高鲤鱼IgM抗体水平；血清中非特异性免疫指标呈上调趋势，表明重组乳酸菌可提高鲤鱼的体液免疫水平；各组织中免疫相关细胞因子表达量均有不同程度的上升，表明重组乳酸菌可增强鲤鱼的细胞免疫水平；各肠段经菌落计数后表明3株重组乳酸菌均能定植于鲤鱼肠道，且前、中及后肠存在重组菌数量不一致，中肠和后肠的定植能力较强；攻毒试验结果表明本研究所构建的3株重组乳酸菌可以抵抗针对维氏气单胞菌的感染，其相对保护率分别为53.57%、64.29%和60.71%。 LC-pPG-Aha1-CTB和LC-pPG-Aha1-LTB重组乳酸菌的各项免疫指标均高于LC-pPG-Aha1重组乳酸菌，表明黏膜免疫佐剂的加入可增强体液免疫和细胞免疫。 综上所述，本试验成功构建3株重组乳酸菌LC-pPG-Aha1、LC-pPG-Aha1-CTB和LC-pPG-Aha1-LTB，经口服免疫后可诱导鲤鱼产生较高IgM抗体水平，增强AKP等相关酶活性，并促进鱼体内相关细胞因子的转录水平，增强机体免疫力，研究结果为水产养殖业口服乳酸菌递呈载体疫苗的研发和黏膜免疫佐剂的应用提供理论基础。
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