摘要
鱼类脂肪肝疾病是全世界水产养殖中最常见的营养性疾病，尤其在我国淡水养殖品种中高发，肝脏脂肪沉积是诱导脂肪肝发病的主要原因，乳酸菌作为典型益生菌，在水产领域中的研究证明其能够调节机体免疫力，但乳酸菌缓解鱼类脂肪肝的研究也相对较少，其降脂的分子机制也尚不明确。因此，本研究以乌鳢（Channaargus）作为试验动物，采用干酪乳杆菌（Lactobacilluscasei）、植物乳杆菌（Lactobacillusplantrun）和鼠李糖乳杆菌（Lactobacillusrhamnosus）进行干预，通过体内试验和体外试验探究3株乳酸菌缓解C.argus脂肪肝的分子机制，为C.argus健康养殖提供科学依据，同时为乳酸菌在水产养殖业的应用开辟新思路。本研究内容共五部分，研究结果如下： (1)C.argus脂肪肝模型建立 为探究C.argus脂肪肝形成的分子机制，在基础饲料的基础上设立脂肪含量为9%（Control）、16%（L16）和22%（L22）的高脂饲料，连续饲喂C.argus90d，于30d、60d和90d进行取样，通过组织切片观察，结果表明90d后Control组肝脏切片细胞紧密且无空泡，L22组和L16组肝细胞存在大量脂滴，且L22组呈网状结构，L22组血清和肝脏中TG和TC含量显著升高，血清中抗氧化酶CAT、SOD和GSH-Px酶活水平显著下降。进一步研究发现L22组肝脏NF-κB表达水平显著高于L16组和Control组，且L22组细胞凋亡相关基因Bax、Cas3、Cas8和Cas9的表达水平也显著高于L16组和Control组，L22组血清中GOT和GPT水平显著高于L16组和L22组，证明脂肪水平为22%的饲料饲喂C.argus能够成功诱发C.argus脂肪肝。 (2)基于转录组技术探寻高脂饲料诱发C.argus脂肪肝的关键基因 在C.argus脂肪肝模型建立的基础上，通过转录组测序，分析高脂组与对照组差异基因，结果表明，高脂组与对照组间差异基因GO富集涉及到158个通路，KEGG富集高达312个条信号通路，其中主要机体免疫调节、应激调节和脂肪代谢相关。相对于对照组，高脂饲料能够显著上调机体炎症因子和凋亡相关基因的表达，同时抑制C.argus肝脏PPARα、ACOX1和LPL等脂肪降解相关基因表达，同时抑制LXRα和SREBP-1c等胆固醇代谢相关基因的表达，因此推测这些是高脂饲料导致C.argus脂肪肝的关键基因。 (3)三株乳酸菌对C.argus生长、免疫、抗氧化和肠道菌群的影响 为探究L.casei、L.plantarum和L.rhamnosus对C.argus生长、免疫、抗氧化功能和肠道菌群的影响，使用3株乳酸菌调整至1×109CFU/mL包被饲料，饲喂C.argus56d后取样，检测生长性能、饲料效率、抗氧化指标、免疫指标以及肠道菌群丰度。结果表明，饲料中添加L.casei和L.rhamnosus降低C.argus肠道Proteobacteria的相对丰度，改善肠道菌群结构。相对于Control组，饲料中添加L.rhamnosus能够提高C.argus生长性能和饲料效率，而且L.casei、L.plantarum和L.rhamnosus提高C.argus血清和组织中SOD、CAT和GSH-Px酶活水平，上调组织中SOD和GST基因的表达，激活宿主免疫系统，提高C.argus的抗氧化能力和免疫力，抵抗A.hydrophila感染，且L.rhamnosus保护效果高于其他2组，保护率高达50%，而L.casei和L.plantarum保护率分别为37.5%和40%。 (4)三株乳酸菌对高脂饲料诱导C.argus脂肪肝的影响 在C.argus脂肪肝模型的基础上，用L.casei、L.plantarum和L.rhamnosus对高脂饲料进行包被，连续饲喂90d后，测定肝脏脂质水平、炎症因子、抗氧化酶活以及肠道菌群。切片Hamp;E染色和油红O染色能够观察到L.casei、L.plantarum和L.rhamnosus能够改善高脂饲料诱导的C.argus脂肪肝症状。L.casei和L.rhamnosus能够改善肠道菌群结构，抑制Protenateria的相对丰度，且L.rhamnosus通过激活PPARα调控下游ACOX1和LPL基因表达，缓解C.argus脂肪肝症状；L.casei通过激活LXRα和LPL参与调节脂代谢，缓解C.argus肝脏脂肪沉积；L.plantarum对肠道菌群丰度并未产生显著影响，与L.casei和L.rhamnosus不同，L.plantarum通过激活LXRα调控SREBP-1c基因表达，缓解C.argus脂肪肝症状。 (5)基于PPARα/LXRα体外探究三株乳酸菌缓解高脂饲料诱导C.argus脂肪肝的机制采用油酸（OA）构建C.argus原代肝细胞脂肪沉积模型，结果表明OA浓度为2.5mmol/L是能够显著提高TG、LDL和FFA含量，同时抑制脂代谢关键基因PPARα和LXRα的表达，导致脂肪沉积现象。在此基础上，采用GW6471和GSK2033分别抑制PPARα和LXRα探究L.casei、L.plantarum和L.rhamnosus缓解脂肪沉积的分子机制。结果表明，L.rhamnosus通过激活PPARα上调，进而激活ACOX1和LPL的转录水平，抑制PPARα活性后，上述基因表达水平显著下调，胞内TG水平显著上升，而抑制LXRα活性时，胞内TG水平与L.rhamnosus和OA组无差异；L.plantarum通过激活LXRα表达，降低LDL和FFA含量，抑制PPARα活性后，上述基因表达水平无显著变化，胞内TC和FFA水平与L.plantarum和OA组无差异，而抑制LXRα活性时，胞内脂质水平显著升高；L.casei通过调节PPARα、LXRα和LPL的上调表达，抑制PPARα和LXRα均会导致胞内脂质水平升高。 综上所述，体内试验证明L.casei、L.plantarum和L.rhamnosus能够有效缓解高脂饲料诱导的C.argus脂肪肝症状，其中L.rhamnosus的降脂效果略优于其余两株。体外试验进一步证明L.casei、L.plantarum和L.rhamnosus缓解脂肪肝症状的分子机制不尽相同，本研究结果为C.argus脂肪肝的发病机制的研究提供科学参考，同时也为解决当前水产养殖经济品种脂肪肝提供理论基础。
NETL