摘要
铁（Fe）是植物生长必需的微量营养元素，对于各类生命活动都有极其重要的意义，如光合作用、呼吸作用等。即使铁在土壤中含量很高，但铁在中性和碱性土壤中通常以稳定的不溶性铁络合物的形式存在，导致植物铁吸收能力降低，抑制其生长和发育，因而降低作物产量和营养品质。因此，发现和鉴定调控植物缺铁胁迫响应的新基因并研究其作用机制，对于利用分子育种途径提高植物铁吸收能力无疑具有重要的理论意义和潜在应用价值。本文通过反向遗传学方法，鉴定了一个参与拟南芥缺铁胁迫响应调节的WRKY转录因子WRKY12，并研究了其可能的作用机理。主要研究结果如下： （1）对WRKY12基因的缺铁诱导表达以及缺铁诱导下的ProWRKY12染色结果进行分析，发现WRKY12基因在受到缺铁诱导后表达量上调，同时GUS染色结果显示在受缺铁诱导后，WRKY12在拟南芥根部表达升高，表明WRKY12基因可能参与植物缺铁胁迫响应调节。 （2）对wrky12突变体植株的表型分析发现，在正常条件下，wrky12突变体和野生型植株无显著差异，但在受到缺铁胁迫后，wrky12突变体较野生型植株表现更为耐受，表明WRKY12基因负调控缺铁胁迫响应。 （3）进一步对35S:WRKY12过表达植株进行表型分析发现，在正常条件下，35S:WRKY12过表达和野生型的表现型无显著差异，而在缺铁条件下，35S:WRKY12过表达比野生型更敏感。 （4）分析野生型、wrky12突变体和35S:WRKY12过表达植株中根和茎中的铁含量发现，正常条件下，wrky12突变体、35S:WRKY12过表达和野生型植株根中或茎中的铁含量无显著差异，但在缺铁胁迫下，wrky12突变体植株根和茎中的铁含量较野生型显著升高，而35S:WRKY12过表达植株根中和茎中的铁含量显著低于野生型根和茎中的铁含量。 （5）利用荧光定量PCR方法分析了wrky12突变体中与缺铁胁迫响应有关的基因表达，结果表明，与野生型相比，在缺铁胁迫下，wrky12突变体中FIT、IRT1、FRO2、bHLH38、bHLH39基因表达量显著升高，而BTS与BTSL1基因的表达量有所下降，PYE基因转录水平在突变体与野生型植株中并不存在明显差异，推测WRKY12可能参与FIT、IRT1、FRO2、bHLH38、bHLH39、BTS与BTSL1基因表达的调节，从而调节拟南芥在缺铁胁迫中的应答。 （6）进一步通过烟草瞬时表达实验，证明WRKY12可激活编码E3泛素连接酶的BTSL1的表达，推测WRKY12基因通过调节BTSL1的表达来调控植物缺铁响应。 （7）为进一步确定WRKY12是否直接结合BTSL1基因启动子上，利用酵母单杂交实验发现，WRKY12蛋白可以和BTSL1启动子上的W-box结合。结合烟草瞬时表达实验的结果，表明WRKY12通过直接结合BTSL1的启动子激活BTSL1基因的转录。 综上所述，WRKY12基因参与植物缺铁胁迫应答，其调控机制可能是通过激活BTSL1基因的表达来调节下游相关基因表达，进而维持植物体内的铁稳态。 该研究不仅有助于揭示植物响应缺铁胁迫的新机制，同时给农作物矿物营养分子育种带来了新的技术手段，基因资源更加丰富化。
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