摘要
研究目的 肺纤维化（pulmonaryfibrosis,PF）是众多肺部疾病中晚期的共同结局，而结缔组织病相关肺间质病变（interstitialpulmonarydiseasewithconnectivetissuedisorders,CTD-ILD）是纤维化的重要类型，并且预后非常差。虽然肺纤维化病因不同，但其病理改变均以弥漫性肺泡炎、肌成纤维细胞增殖及胶原沉积为特征，最终导致肺组织结构破坏，引起肺功能衰竭，是一种危害性极大的慢性进行性的不可逆疾病。迄今肺纤维化的发病机制仍未清楚，且治疗手段匮乏。免疫紊乱是组织炎症进展为纤维化的重要因素。本研究旨在揭示免疫调节性T细胞——CD4+CD25-LAG3+Tregs及其分泌因子TGF-β3在调控肺纤维化方面的作用，并探究其调控机制，判断LAG3+T细胞亚群是否具有生物学标志物的价值，为CTD-ILD的机制研究和治疗方法提供新靶点和新思路。 研究方法 首先收集患者肺组织及外周血标本，观察对比肺组织病理变化，检测外周血中CD4+LAG3+Tregs比例以及细胞因子TGF-β3的表达水平，并且收集这些患者相关临床检查数据进行分析。 其次，在细胞共培养后，观察CD4+LAG3+Tregs对人肺成纤维细胞（humanlungfibroblasts,HLFs）增殖、迁移、侵袭等细胞功能的影响，以及p-Smad3、α-平滑肌肌动蛋白（α-smoothmuscleactin,α-SMA）和纤维连接蛋白（Fibronectin）的表达水平，Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的mRNA表达水平，并检测CD4+LAG3+Tregs对巨噬细胞极化的影响。 最后通过博来霉素（bleomycin,BLM）构建C57BL/6小鼠肺纤维化模型，将提取的CD4+LAG3+Tregs单细胞悬浮液经尾静脉注入小鼠体内，在第28d通过眼球取血收集血液标本进行细胞因子分析，而后马上处死小鼠，取肺组织进行组织学检测和生化分析，观察CD4+LAG3+Tregs对肺纤维化的影响。 结果 CTD-ILD患者C反应蛋白、血沉平均值升高，FEV1（%）、FVC（%）、DLCO（%）、6分钟步行距离降低，外周血中CD4+LAG3+Tregs比例、TGF-β3的水平下降。 CD4+LAG3+Tregs能够抑制HLFs增殖、迁移、侵袭等细胞功能，并能够抑制HLFs的p-Smad3、α-SMA和Fibronectin的蛋白表达以及Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的mRNA表达。CD4+LAG3+Tregs和TGF-β3能够抑制M0型巨噬细胞向M1型巨噬细胞极化，却对M2型巨噬细胞极化有促进作用。 肺纤维化模型小鼠肺泡结构明显破坏，肺间质明显增厚，胶原沉积明显增多，羟脯氨酸含量也明显增多，α-SMA和Fibronectin表达量明显增多，而CD4+LAG3+Tregs和TGF-β3能够减轻这些病理改变，TGF-β3中和性抗体则使这些病理改变加重。相较于正常小鼠，肺纤维化小鼠无论是脾脏还是外周血，CD4+LAG3+Tregs比例和TGF-β3水平都有所下降。 结论 CTD-ILD患者C反应蛋白与血沉平均值升高，肺功能变差，外周血中CD4+LAG3+Tregs比例以及TGF-β3水平明显下降。体内、体外实验共同表明CD4+LAG3+Tregs及其分泌TGF-β3能够通过抑制肺成纤维细胞的激活抑制肺纤维化的进展，TGF-β3中和性抗体会减弱此抑制作用。抑制巨噬细胞向M1型极化而促进其向M2型极化可能是CD4+LAG3+Tregs及其分泌的TGF-β3抗炎抗纤维化作用机制之一。CD4+LAG3+Tregs可能具有生物学标志物的价值，这些发现将为临床提供治疗肺纤维化的新靶点和新思路。
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