摘要
磷脂酶D(phospholipaseD，PLD)是一类催化磷酸二酯键水解和碱基交换的磷酸二酯酶，作为一种重要的磷脂改性工具酶，其在食品、医药和日化等行业中展现出巨大的应用价值。然而目前PLD酶蛋白资源开发不足，蛋白结构信息较为缺乏，严重阻碍了对该类酶的结构功能关系理解以及下游的催化应用研究。基于此，本论文以筛选获得的来源于普城沙雷氏菌AS9(SerratiaplymuthicaAS9)和南极细菌JT01(Moritellasp.JT01)磷脂酶D(SpPLD和MsPLD)为研究对象，对其进行重组表达纯化、酶学性质表征以及晶体结构解析，以期为深入理解该酶的结构功能关系以及基于结构的分子改造和下游应用提供指导。具体开展的研究内容与结果如下： (1)PLD的重组表达及酶学性质研究。 分别构建SpPLD和MsPLD的重组表达载体pET21a-SpPLD和pET21a-MsPLD并转化至大肠杆菌SHuffleT7中，获得两种酶蛋白的重组表达菌株。在16℃以0.2mMIPTG诱导，20h后收集菌体，经超声破碎离心获得上清液后，采用Ni2+-NTA和凝胶过滤色谱柱纯化获得高纯度的目的蛋白，经SDS-PAGE检测，SpPLD和MsPLD的分子量分别约为66.4KDa和44.0KDa，与理论预测结果相符。以大豆来源磷脂酰胆碱为底物，采用酶联比色法分别对两种酶蛋白进行酶学性质表征。结果显示：MsPLD对该底物的最适反应温度和pH分别为35.0℃和8.0，测得酶活力为2182.36±11.10U/g；在35℃条件下，MsPLD的半衰期为110min，在4℃条件下半衰期长达41天；该酶对终浓度为50%的有机溶剂(正己烷、乙醚和苯)和终浓度为1%的部分表面活性剂表现出良好的耐受性，于4℃处理1h后，其残余酶活力仍保持80%以上。但SpPLD对该底物未表现出水解活性。 (2)PLD催化合成磷脂酸的研究。 尝试利用两相催化反应体系进行MsPLD催化合成磷脂酸的应用研究，探讨反应体系中不同因素对磷脂酸生成量的影响，最终优化生成PA的最佳条件为：水相和苯比例为4∶1，大豆卵磷脂浓度为40.0mg/mL，加酶量为1.0U，于30℃，800rpm，反应8h后，得到PA浓度为2.37mg/mL。 (3)PLD的晶体结构研究。 对SpPLD进行结晶条件筛选和优化以获得优质晶体，在上海同步辐射光源进行衍射获得其晶体数据，分辨率为1.79?；同时获得SpPLD硒代蛋白晶体，收集其单波长反常散射(SAD)数据，经过相位解析，最终获得SpPLD的蛋白结构，PDBID为7E0M。SpPLD整体结构呈β-α-β-α-β夹心结构，由15个β折叠片，12个α螺旋和一系列有序loop环组成单个不对称球状结构，并由两个高度保守的HxKxxxxD(HKD)催化基序组成催化活性中心。SpPLD与同一家族其它PLDs进行结构比对发现：其在HKD基序下游存在独特的GS-GT基序，以及组成其催化活性中心的loop结构与同一家族中的PLDs存在明显差异。相比于链霉菌来源的PLD(PDBID：1F0I,2ZE4)，其α9和β9之间的loop环较长，且呈现正电性；α10和α11之间对应的loop环则明显变短；此外，SpPLDC末端独特的loop结构参与构成该酶的催化活性中心。 通过优化获得MsPLD-PC晶体，结晶条件为：0.1MHEPESsodium/HClpH7.4，0.8MPotassiumsodiumtartratetetrahydrate，0.2μLSilverBulletsTMA4；经X射线衍射，分辨率约为2.7?。但由于缺乏硒代蛋白晶体数据，无法对MsPLD的相位进行解析，暂未能获得其晶体结构。
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