摘要
免提取探针法一步法逆转录-实时荧光定量聚合酶链式反应（Extraction-FreeProbeOne-StepReverseTranscriptase-QuantitativeReal-timePolymeraseChainReaction，EFPORT-qPCR）作为一种省时省力的核酸检测技术，在食品快速检测领域具有广泛的应用前景。目前，EFPORT-qPCR体系存在检测灵敏度不足和特异性低等问题。逆转录酶为EFPORT-qPCR的核心组分之一，但野生型逆转录酶（W-RT）热稳定性差，抑制剂耐受能力弱。因此改造出具有高抑制剂耐受性的逆转录酶对推动EFPORT-qPCR技术的进步具有重要意义。 本文应用基因工程技术改造野生型莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶（W-MMLVRT），研究了突变型莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶（CMMLVRT）的酶学性质，基于CMMLVRT建立了血液EFPORT-qPCR检测体系。主要研究内容及结论如下： （1）CMMLVRT的重组表达。设计并合成了CMMLVRT基因，构建了pMAL-c2x重组表达载体，实现了CMMLVRT在大肠杆菌BL21的重组表达。优化CMMLVRT的诱导表达条件为：诱导温度25℃、诱导时间12h、诱导剂IPTG浓度0.1mM。采用镍离子亲和层析技术制备电泳纯CMMLVRT储存液，其蛋白浓度为0.247mg/mL，酶活性浓度为1.470×103U/μL。 （2）CMMLVRT酶学性质研究。以两步法RT-PCR扩增结果为依据，优化CMMLVRT缓冲液组成为：50mmol/LTris-HCl、3mmol/LMgCl2、75mmol/LKCl、10mmol/LDTT，pH8.3。CMMLVRT的催化逆转录的反应最适温度为55℃，且在40-75℃温度范围内能够稳定发挥活性。CMMLVRT的热稳定性和延伸能力比W-MMLVRT强，在50℃孵育2h时仍具有79%活性。 （3）CMMLVRT耐抑制剂性能研究。应用两步法RT-qPCR中Ct值（荧光信号达到设定阈值时所经过的扩增循环次数）建立了不同抑制剂对逆转录酶活性抑制率的计算方法。CMMLVRT耐受PCR抑制剂的能力较强，当逆转录体系中存在3.0mmol/LEDTA、0.525U/mL肝素钠、0.75μg/μL黄芪多糖、350mmol/L尿素或15%甲酰胺等抑制剂时，CMMLVRT可保留50%以上的催化活性。 （4）CMMLVRT用于EFPORT-qPCR的相关研究。优化了用于检测血液标本中新型冠状病毒的EFPORT-qPCR反应体系，并确定了最CMMLVRT适添加量、最适探针浓度、最适逆转录温度等检测参数。在2%-8%（v/v）血液添加量下，所建立的检测方法的扩增效率均接近100%，检测方法重复性好，最低检测限与常用的两步法RT-qPCR方法的最低检测限处于同一数量级。
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