摘要
蓝铜胜肽（GHK-Cu）是一种三肽-铜络合物。由甘氨酸、组氨酸、赖氨酸组成的三肽GHK与二价铜离子亲和力很高，两者相遇能自发地形成络合物蓝铜胜肽。时至今日，蓝铜胜肽被许多研究证实有多种功能，包括帮助DNA修复、抗炎症、抗衰老、修复伤口等。蓝铜胜肽作为一种温和的成分，在护肤品应用上已有多年，具有很高的应用价值。目前蓝铜胜肽中的三肽GHK由化学合成生产，生产过程用到大量有机溶剂，对操作人员的健康和环境都不够友好。基因工程技术生产蛋白十分经济便捷，但对小分子多肽来说，其表达量不高、易降解是一大难题。 本研究利用大肠杆菌表达重组多拷贝GHK串联短肽，结合酶解法切割串联短肽以大量生产GHK三肽单体。利用Type-ⅡS型限制性核酸内切酶具有在识别位点下游特定位置切割任意DNA序列的特点，实现了GHK短肽的多次串联延长，基于质粒pUC19成功构建了含31个GHK拷贝的rpUC19-[GHK]31，且GHK的拷贝数能通过酶切连接继续增加。接下来，构建了表达载体pET30a(+)-[GHK]31，将其转入大肠杆菌BL21(DE3)后，成功通过IPTG诱导在大肠杆菌中表达出了重组蛋白[GHK]31，其约占大肠杆菌总蛋白的15%，表达量可达33.5mg/L培养物，解决了基因工程表达短肽的低表达量的问题。 为分离纯化重组蛋白[GHK]31，本研究尝试了离子交换层析、亲和层析、盐析纯化，以及与凝胶过滤、热处理沉淀、等电点沉淀等方法结合进行脱盐，最终确立了盐析-等电点-再盐析沉淀脱盐的纯化脱盐方案。经此法纯化后的重组蛋白[GHK]31纯度大于99.5%，收率为35.9%，产量为12.0mg/L培养物。重组蛋白[GHK]31再经胰蛋白酶酶切释放GHK单体，最后得到了纯度约为98%、产量为6.2mg/L培养物的GHK三肽，无需经过纯化柱即可高效地分离纯化目的蛋白，降低了基因工程法产GHK的生产成本、减轻了化学合成对环境造成的负担。
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