摘要
原人参二醇型人参皂苷CompoundK（CK）为人参和西洋参等珍贵药用植物中的药效成分，在体外细胞实验及动物实验中表现出较强的抗炎、保肝、抗糖尿病、抗癌等活性。目前人参皂苷类化合物主要通过从植物中分离提取或从其他皂苷水解获得，但由于人参属植物资源紧张、分离过程复杂等问题，严重限制了人参皂苷CK的广泛应用。而利用合成生物学技术改造酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）细胞工厂生产天然产物，既能避免化学合成和分离提取带来的各类棘手问题，又能控制原料供给、降低生产成本。 本研究以酿酒酵母BY4742为出发菌，通过强化甲羟戊酸途径及氧鲨烯途径后，又异源表达来源于人参的达玛烯二醇合酶（DamarenedialcoholⅡsynthase,DDS）基因以及原人参二醇合酶（Protopanaxadiolsynthase,PPDS）基因得到工程菌AP，在对该工程菌发酵产物的测定过程中发现多个中间体物质包括达玛烯二醇（DammarenediolⅡ,DD）和鲨烯（Squalene,SQ）大量积累，产物原人参二醇（Protopanaxadiol,PPD）的产量和转化效率低。脂滴是酵母细胞中特殊的细胞器，具有暂时储存胞内疏水性物质的能力，因此提取AP菌株的脂滴进行分析，定性和定量结果均表明大部分DD和鲨烯存储在脂滴中，同时荧光共定位分析表明DDS主要分布于内质网和脂滴，PPDS主要分布于内质网。因此AP工程菌中存在酶与底物区室隔离的问题，影响酶的催化效率致使前体积累。 随后首次利用脂滴膜蛋白Pln1p对PPDS和DDS进行区室定位以解决酶与底物空间上的隔离，并通过荧光共定位分析佐证酶的成功区室定位。检测结果显示，DDS的区室定位并没有改善DD代谢流，而对PPDS的区室定位成功使PPD的转化率提高到86.43%，是对照菌株PTA的2.58倍。后续进一步通过强化TAG生物合成和敲除SEI1基因来调控脂滴的大小和数量，并对不同脂滴形态下PPD的转化率和产量进行了评估。 在高转化率PPD的底盘菌株中引入来源于三七的糖基转移酶Synpn3-29，并通过不断强化该模块的表达分别获得高产人参皂苷CK工程菌，通过分批补料发酵的方式在5L高密度发酵罐中发酵人参皂苷工程菌，最终CK工程菌的高密度产量达4879mg/L，为迄今为止报道的人参皂苷类物质合成的最高产量。
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