摘要
马氏珠母贝（Pinctadafucatamartensii）又称为合浦珠母贝，是我国主要的海水育珠的珍珠贝之一，作为无脊椎动物的一员，由于缺乏获得性免疫系统，其先天性免疫系统便承担起抵御潜在病原体入侵机体的职责。因此，探究其机体免疫作用机制成为时下研究重点，免疫系统失调会导致细胞死亡，为了确保机体保护机制不会对自身产生不利影响，体内各类细胞通过细胞凋亡来维持着自身的平衡。细胞凋亡是指机体生理或者病理条件下，为了维持自身内环境稳态，通过基因调控而产生的主动、有序的细胞死亡。研究人员前期对马氏珠母贝同、异种植核，高温处理以及弧菌感染等不同免疫刺激后马氏珠母贝机体免疫应答机制进行研究，结果表明细胞凋亡在这些过程中均发挥着重要的作用，但是在这些过程中有些是促进细胞凋亡的基因或蛋白发挥着重要的作用，有些是抑制细胞凋亡的基因或蛋白发挥着重要的作用，那么细胞凋亡在马氏珠母贝体内究竟发挥怎样的作用以及如何发挥作用呢？基于上述问题，本研究基于课题组之前构建的马氏珠母贝基因组、植核前后不同时间点转录组和蛋白质组数据库对马氏珠母贝内源性细胞凋亡通路关键基因进行筛选，利用RACE技术克隆得到了马氏珠母贝2个Bcl-2家族基因和2个Caspase家族基因，随后通过实时荧光定量PCR、酵母双杂交、亚细胞定位等对上述基因开展了功能研究，实验结果如下： （1）马氏珠母贝内源性细胞凋亡通路关键基因的克隆：结合马氏珠母贝基因组、植核后不同时间点转录组及蛋白质组数据，筛选出马氏珠母贝内源性细胞凋亡通路关键基因。通过RACE克隆得到四个基因分别命名为PmBak、PmBcl-2、PmCaspase-9/2以及PmCaspase-3。PmBakcDNA全长为1213bp，编码233个氨基酸；PmBcl-2cDNA全长为1052bp，编码250个氨基酸；PmCaspase-9/2cDNA全长为1680bp，编码427个氨基酸；PmCaspase-3cDNA全长为2233bp，编码695个氨基酸。通过多序列比对及进化树构建发现，马氏珠母贝Bcl-2家族和Caspase家族基因与其他物种序列相似度较高。 （2）不同发育阶段和不同组织中关键基因的相对表达量分析：通过荧光定量PCR对4个基因进行不同发育阶段相对表达量检测，发现PmBak、PmBcl-2、PmCaspase-9/2在胚胎期表达量较高，且均在受精卵表达量最高；PmCaspase-3则在幼虫时期表达量较高，在眼点期表达量最高；检测上述基因在不同组织的相对表达量，发现PmBcl-2和PmCaspase-9/2在鳃组织中表达量最高；PmBak和PmCaspase-3在肝胰腺中表达量最高。 （3）不同免疫刺激后关键基因在鳃组织和肝胰腺中表达量分析：通过RT-PCR检测不同刺激后关键基因的相对表达量，发现两个家族基因在受到不同刺激后基本呈现类似的表达模式。在LPS、PGN和PolyI:C刺激后PmBak、PmBcl-2、PmCaspase-9/2、PmCaspase-3分别在48h、24h以及72h表达上调。 （4）关键基因的功能研究：对PmBak、PmBcl-2进行RNA干扰，干扰后PmBak、PmBcl-2在前期呈现不同的表达模式，但在48h两个基因相对表达量均呈现显著下调，且下游基因PmCaspase-9/2、PmCaspase-3同样出现表达量下调现象；进一步的酵母双杂交实验表明PmBak和PmBcl-2可以相互作用；通过凋亡诱导及亚细胞定位发现PmBak蛋白在发生细胞凋亡时转位到线粒体；此外，在受到同种免疫刺激后，Caspase-9/2及Caspase-3蛋白酶活力呈现出较为一致的表达模式。 本研究通过对马氏珠母贝内源性细胞凋亡通路关键基因的克隆及功能研究，初步了解了马氏珠母贝内源性凋亡通路受到免疫应激后的作用模式，为了解无脊椎动物免疫应答机制提供了新的思路。
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