棉花既是一种重要的纤维作物，也是重要的油料作物。由于棉花生育期较长，从播种到收获期间生长发育的各个时期都会受到多种虫害的影响，因此虫害已经成为影响棉花产量和纤维品质的重要因素之一。棉花作为世界上四大转基因作物之一，Bt棉的应用在一定程度上控制了鳞翅目害虫带来的影响，但导致刺吸式等非Bt基因靶标害虫危害的日益加重逐步成为危害棉花的主要害虫，迫使杀虫剂大量喷施，造成多种害虫对农药的抗性随之进化，这不仅增加了棉花种植成本而且破坏生态环境。另一方面随着Bt棉种植区域的扩大和种植时间的不断延长，害虫对Bt棉的抗性也随之增强，其带来的风险也不容忽视。因此目前需要开发新的策略应用于棉花抗虫研究。鉴定棉花内源抗虫基因用于抗虫育种，可以有效补充Bt棉在抗虫应用中的不足。而开发一种高效、可靠的基因功能分析策略是进行棉花功能基因组学研究的重要方向。 CRISPR/Cas9系统现已成为一种强大而有效的基因编辑工具。本课题组已经在棉花中成功构建的高效、精确的适用于棉花的CRISPR/Cas9基因组编辑系统使得大规模构建基因编辑突变体材料成为可能。本研究介绍了一种利用CRISPR/Cas9系统的高效筛选棉花内源抗虫相关基因突变体库构建的方法，为棉花功能基因组学和育种方向研究提供了高效的新策略。主要取得了以下研究结果： 1.sgRNA设计与载体文库构建 本研究从之前的转录组和代谢组学分析中选择了528个差异基因，通过全基因组比对筛选到968个高特异性的sgRNA靶向502个基因。通过混合引物池的方法经一次引物设计、PCR扩增和载体克隆，只需花费构建一个载体的时间就可以快速构建大规模载体文库。 2.棉花基因组编辑突变体库创建及目的基因识别 利用农杆菌介导的遗传转化和组织培养过程，共获得达5000多个独立的胚性愈伤组织，获得2000多独立的基因编辑T0棉花植株。本研究使用基于条形码的高通量测序技术对T0植株的目的基因进行测序分析。我们对1380个T0植株和576份愈伤组织检测了sgRNAs并鉴定了其序列，共鉴定出555条靶向412个基因的不同sgRNA序列，已检测突变体材料的基因覆盖率达82.07%。 3.高效的编辑率和遗传率 通过高通量测序，软件分析和人工筛选，共获得369个有效T0代基因组编辑数据。结果显示T0代发生有效编辑比例达97.29%，其中，75.61%材料表现出高效的突变率，编辑率超过80%，编辑类型以短片的插入缺失为主。棉花基因组编辑位点平均遗传力高达84.78%。 4.低脱靶风险 通过高通量测序对9个潜在的脱靶位点进行了检测，结果中没有发现有任何脱靶效应产生，进一步证实CRISPR/Cas9系统在棉花基因组编辑中发生脱靶概率低，具有很高的特异性。 5．高效的表型鉴定率 在对200个株系的T1和T2代昆虫生物测定中发现有超过10%的基因突变体材料表现出对虫害的抗性改变。表明针对特定性状（本研究是针对抗虫性状）构建高通量突变体库进行特定性状表型筛选是一种高效的候选基因筛选策略。 6．抗虫相关候选基因 通过抗虫鉴定发现GhMLP423、GhDML1、GhZAT10等基因的突变材料表现出一致的抗性改变表型。本研究所鉴定得到的候选基因在植物抵抗生物和非生物胁迫方面都发挥了十分重要的作用。通过初步验证发现GhMLP423可能参与棉花抗虫相关JA信号路径传导。 本研究利用CRISPR/Cas9系统构建了一个同时使用近千个sgRNA针对植物基因组上数百个基因的混合载体文库，并快速生成一个用于表型筛选的高覆盖度的突变库，并鉴定到一些抗虫相关候选基因。该技术为棉花功能基因组学研究提供了坚实的基础。本研究方法也适用于其他基因组复杂的多倍体植物，对其他作物研究具有一定的参考价值。
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