摘要
油菜是我国重要的油料作物。已有研究表明油菜黄籽较黑籽性状在品质方面具有多方面的优势。但是作为我国主栽的油菜类型，甘蓝型油菜还未发现天然的黄籽突变体。目前生产上的黄籽材料大多通过远缘杂交而来，这种人工合成的方法不仅费时费力，而且获得的黄籽颜色具有较大的变异，不利于黄籽性状的研究。国内外研究者对油菜的黄籽性状开展了大量的遗传和基因定位的相关研究，结果表明黄籽性状遗传十分复杂，至今也没有克隆到相关的基因，这也极大限制了我们对甘蓝型油菜黄籽性状形成的分子机制的认识。拟南芥和白菜型油菜中的研究表明，TT8是参与黄籽性状形成的重要基因。因此，本研究首次利用CRISPR/Cas9技术对甘蓝型油菜中的BnaTT8基因进行靶向突变，获得黄籽材料；在此基础上，对其参与调控种子中的含油量、蛋白质含量和脂肪酸组分等方面的功能进行了研究，同时利用转录组和代谢组对其参与调控种皮颜色的机理进行了初步解析，研究结果如下： 1．根据生物信息学分析和基因克隆，初步确定BnaTT8基因在甘蓝型油菜基因组中存在3个同源拷贝。通过qPCR技术分析BnaTT8基因在甘蓝型油菜J9707不同组织中的表达模式，发现BnaC09.TT8a在这些组织中均未检测到基因的表达，而BnaA09.TT8和BnaC09.TT8b在各组织中均有表达，尤其在种子中特异性高表达；其中BnaA09.TT8拷贝的表达量显著高于BnaC09.TT8b拷贝。对BnaA09.TT8和BnaC09.TT8b在种皮不同发育时期的表达模式进行分析，发现它们的表达从开花7天后开始随着种子的发育呈现出先增加后降低的趋势，且在开花21天后达到峰值。通过进一步分析TT8的蛋白质功能域，确定了BnaTT8基因在甘蓝型油菜J9707基因组中具有2个有功能的拷贝BnaA09.TT8和BnaC09.TT8b。 2．设计和构建了BnaTT8基因的CRISPR/Cas9载体。将其转化J9707，获得了420棵T0代植株，对靶点进行测序筛选到48株突变体。对这些突变单株进行两代自交和筛选，获得了9个不含T-DNA插入的纯合突变体单株。其中仅双突表现为黄籽表型，表明这两个拷贝功能冗余。 3．利用香草醛和DMACA等化学染色方法对种皮发育过程中的原花色素积累进行了动态分析，发现野生型和单纯合突变体从开花后21天开始出现原花色素积累，并随着种子的发育积累变多；而双纯合突变体中始终未检测到原花色素的积累。 4．显微观察发现原花色素只在野生型和单纯合突变体的种皮内皮层中积累。对成熟种子的种皮厚度进行比较分析，发现双突变体和BnaA09.TT8拷贝突变体的种皮厚度比野生型显著降低。 5．对T0和T2代的突变体种子中的脂肪酸、油分和蛋白质含量测定分析，发现相对于野生型，双突变体的含油量和蛋白质含量显著增加，脂肪酸组分也发生了显著的变化。田间小区试验结果表明，突变体材料的主要产量相关性状与野生型相比没有发生显著性变化，表明该基因突变体具有较大的应用潜力。对30株T0代突变体进行了26个潜在突变位点的高通量测序检测，均未发现脱靶现象，表明该基因编辑系统具有很好的特异性。 6．对纯合双突变体和野生型进行了开花后14天和35天种皮的转录组比较分析，总共筛选到1,298个差异表达基因，其中145个差异表达基因为两个时期所共有。GO功能注释和KEGG富集分析表明，双突变体中的苯丙烷和类黄酮合成代谢过程中的基因较野生型显著下调。对双突变体和野生型的成熟种子进行代谢组比较分析，结果也发现双突变体中类黄酮合成途径的大部分代谢物含量较野生型显著降低。 7．对突变体和野生型不同发育时期种子中参与脂肪酸合成和积累的重要转录因子和关键酶进行基因表达检测，发现在14和28DAF的突变体种子中，BnaFUS3和BnaFAD2的表达量均显著上调，BnaLEC1的表达量在14DAF的突变体种子中也显著上调。这些结果表明，BnaTT8基因在调控脂肪酸的合成积累方面也具有重要的作用。 综上所述，本研究成功创建了甘蓝型油菜BnaTT8基因突变体，证实它在调控籽粒颜色、蛋白质和油分含量以及脂肪酸组分等方面具有重要的功能，并通过转录组和代谢组初步阐明其参与调控种皮中的类黄酮积累、种子脂肪酸的合成等方面的调控机理。本研究为进一步研究该基因的功能及其调控的分子机理奠定了良好的材料基础，也为甘蓝型油菜的黄籽育种提供了优异的种质资源。
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