摘要
苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis,Bt)是一种革兰氏阳性细菌，其区别于其它芽胞杆菌的显著特征是，其在形成芽胞的同时，伴有伴胞晶体的产生。当芽胞完全成熟后，母细胞破裂，释放出游离的芽胞和伴胞晶体。但少数Bt的伴胞晶体形成于芽胞衣与芽胞外壁帽子结构之间，在母细胞裂解后伴胞晶体与芽胞不分离，始终粘连在一起，形成晶胞粘连现象(Spore-CrystalAssociation,SCA)。晶胞粘连表型的形成一方面需要特定的蛋白，另一方面需要得以附着的结构，如芽胞衣和芽胞外壁帽子结构。但决定该表型的关键芽胞表面蛋白(芽胞衣和芽胞外壁蛋白合称芽胞表面蛋白)有哪些还不清楚。 为找到形成晶胞粘连表型需要的所有芽胞表面蛋白，本研究利用CRISPRi技术对苏云金芽胞杆菌C15中所有芽胞表面蛋白基因进行基因表达抑制处理。现已通过改造并构建了适用于菌株C15的CRISPRi敲降技术，成功构建了104个基因的敲降载体，获得了69株基因的干扰菌株。对这69株菌株进行晶胞粘连表型的观察，发现其中21株干扰菌株的晶胞粘连比率显著降低。结合本实验室前期构建的芽胞表面蛋白相互作用网络，分析这21株干扰菌株中被干扰蛋白的相互作用网络，发现双功能蛋白CalY为相互作用网络上的关键结点，推测蛋白CalY是影响晶胞粘连的关键蛋白。荧光定位实验发现芽胞表面蛋白CalY在稳定期前期定位于母细胞的细胞膜上，母细胞裂解后CalY只定位于芽胞衣上，说明蛋白CalY在结构层面上是一种芽胞衣蛋白。另外观察了晶体蛋白Cry21-99在细胞内的移动轨迹，发现晶体蛋白Cry21-99的移动轨迹与芽胞衣蛋白CalY的具有一致性。MST实验显示蛋白CalY与晶体蛋白Cry21-99存在体外相互作用。共定位实验观察到晶体蛋白Cry21-99后于芽胞衣蛋白CalY表达，其先在芽胞囊中聚集后定位于芽胞衣和芽胞外壁之间，CalY的定位先于Cry21-99的完成。以上结果说明，菌株C15中多种芽胞表面蛋白参与晶胞粘连现象的形成，发现其中此前未见其与芽胞结构有关系的CalY是一种芽胞衣蛋白并且是晶胞粘连现象形成过程中与晶体蛋白的定位密切相关的蛋白。
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