摘要
野木瓜（stuantoniachinensisDC.）是一味具有抗炎镇痛作用的传统中药，临床上用于抗炎、抗菌和镇痛等方面的治疗。研究表明，由野木瓜提取物制成的野木瓜注射液具有镇痛作用，其镇痛机制可能与抑制电压门控型钠通道电流和瞬时感受器电位香草酸亚型1（transientreceptorpotentialvanilloid1，TRPV1）电流有关。研究表明野木瓜的主要药理成分是野木瓜的皂苷类成分（TriterpenoidsaponinsfromStauntoniachinensis，TSS）。因此，我们推测提取于野木瓜中的TSS镇痛机制可能与TRPV1有关联。通过对野木瓜总皂苷镇痛机制及关键成分的研究，为其临床应用提供了药理基础。本课题将以TRPV1作为潜在的镇痛靶点，探究TSS的镇痛机制，以及TSS中何种成分在该镇痛机制中起着关键作用。 运用全细胞膜片钳技术，观察不同浓度TSS对1μM辣椒素（capsaicin，CAP）诱发的TRPV1电流峰值对DRG神经元中TRPV1电流影响。实验结果显示，TSS可以浓度依赖性抑制TRPV1电流，其半数抑制浓度（thehalfmaximalinhibitoryconcentration，IC50）为0.9998±0.0145μg/mL。在动物疼痛模型实验中，TSS对热刺激、福尔马林、辣椒素和冰醋酸引起的小鼠急性疼痛具有显著镇痛效果；对CFA诱导的慢性炎性痛也具有镇痛作用，我们推测TSS的镇痛机制可能与抑制TRPV1电流有关。有研究表明，TRPV1蛋白表达量与痛觉信号的传导密切相关，因此我们提取CFA诱导的慢性炎性痛模型的大鼠背根神经节（dorsalrootganglia，DRG）神经元进行WestrnBlot实验，实验结果显示TSS可以下调TRPV1蛋白表达。综上所述，TSS通过抑制DRG神经元中TRPV1电流，抑制动作电位产生，以及下调TRPV1蛋白表达，阻滞痛觉信号的传导，进而起到外周镇痛作用。 TSS是皂苷类成分的混合物，其中可能存在诸多无效成分，或者减弱其镇痛效果的成分，因此，探究TSS中调控TRPV1进而产生镇痛的关键成分尤为重要。本课题前期研究表明，TSS可以抑制TRPV1电流。那么有可能是TSS中一种单体或者几种单体对TRPV1电流产生抑制作用，同时可能某些单体对TRPV1电流的抑制效果并不显著，但存在于单体组合后可以有较好的作用。因此，在实验过程中不适合只观察某种单体的作用效果，我们采用分别去除某种单体后剩余的单体组合的反向筛选方式，这种方式便于我们推测去除单体以及所剩单体组合的对TRPV1电流的作用效果。设置9个实验组：8种TSS单体组合（每种单体浓度为2μM），即8单体组；去除YF30后7种TSS单体组合，即-YF30组；以此类推分别有-YF32组；-YF33组；-YF35组；-YF39组；-YF40组；-YF49组；-YF50组。实验结果显示，与8单体组相比，-YF30组、-YF32组、-YF33组、-YF39组、-YF40组、-YF49组和-YF50组均无显著差异，表明8种单体分别去除YF30、YF32、YF33、YF39、YF40、YF49和YF50后并不影响其对TRPV1电流的抑制作用；-YF35组对TRPV1电流具有促进作用，表明去除YF35后，剩余7种单体无法起到对TRPV1电流的抑制作用。综上所述，这8种单体对DRG神经元上TRPV1电流具有较好抑制作用的主要成分是YF35。因此，我们推测YF35是TSS调控TRPV1，进而起到镇痛作用的关键成分。 运用全细胞膜片钳技术，观察不同浓度YF35对TRPV1电流的影响。实验结果表明，YF35可以浓度依赖性抑制TRPV1电流，其半数抑制浓度为0.0369±0.0044μM。为探究YF35是通过何种方式抑制TRPV1电流，我们在不施加YF35和施加YF35的情况下，将不同浓度辣椒素诱发的TRPV1电流标准化，绘制出辣椒素量效曲线，结果显示YF35使辣椒素量效曲线右移，但不降低其最大能效。实验结果表明，YF35可以竞争性拮抗辣椒素诱发的TRPV1电流。动物疼痛模型实验中，4μMYF35对辣椒素和冰醋酸引起的急性疼痛具有显著镇痛效果。上述实验表明，表明YF35的镇痛机制可能与直接作用于TRPV1有关。WesternBlot实验结果显示，DRG神经元经0.1μMYF35孵育24h后，TRPV1蛋白表达下降。综上所述，YF35可以抑制DRG神经元上TRPV电流以及下调TRPV1蛋白表达，是TSS调控TRPV1的关键成分。 本课题研究表明，TSS通过抑制DRG神经元中TRPV1电流，抑制动作电位产生，以及下调TRPV1蛋白表达的调控方式，阻滞痛觉信号的传导，进而起到外周镇痛作用。同时TSS中调控TRPV1起到镇痛作用的关键成分是YF35。
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