摘要
小细胞外囊泡（SmallExtracellularVesicles，sEV）是多种哺乳动物细胞自发或在一定条件下释放出的一种由脂质双分子层包裹形成的闭合球形囊泡。sEV富含多种蛋白质、核酸、脂类等生物活性物质，在多种生理病理发展过程中扮演着重要的作用；sEV可以作为标记物诊断疾病、监测疾病进展、评估预后，也可以作为药物或药物载体，在维持生理状态和治疗疾病中发挥着重要作用。因此，对分离的sEV进行体外标记或活体示踪对于其功能研究具有重要意义。 现有的sEV标记方法主要分为荧光法和物理法。荧光法多用于生物医学研究中，但目前所使用的荧光法存在明显不足，如以非共价方式嵌入胞外囊泡膜双层的荧光染料PKH-67等，会在与胞外囊泡相似的水溶液中聚集，给实验结果带来误差；常用的膜渗透型荧光染料如CFDA-SE在细胞内的酸性条件下荧光强度很弱，无法用于标记内吞进溶酶体的sEV。物理法使用放射性同位素标记sEV，由于具有较高的分辨率和灵敏度，更适用于深部组织中sEV的示踪成像，但操作步骤复杂，仪器昂贵，且该方法中的放射性同位素标记会产生电离辐射，因此限制了其应用。所以迫切需要开发一种能够有效地观察和追踪sEV的技术。 基于以上问题，本研究设计并合成了一种耐低pH的新型荧光探针ExoTracker。ExoTracker以N-羟基琥珀酰亚胺酯为识别基团，以吲哚类半花菁染料为荧光基团。当有sEV存在时，ExoTracker通过N-羟基琥珀酰亚胺酯与sEV膜上蛋白氨基发生酰胺化反应，荧光探针分子构象发生改变，抑制了TICT（TwistedIntramolecularChargeTransfer）效应，从而使与其结合的sEV具有荧光标记，再借助流式细胞术、荧光成像等生物学手段对被标记的sEV进行可视化研究。本研究合成的荧光探针ExoTracker无需复杂的多步反应，无需额外的化学修饰，与其它荧光化合物相比具有操作简单、灵敏度高、分辨率高、低pH耐受以及生物相容性好等优势。 本文具体研究内容如下： （1）本研究以1,1,2-三甲基-1H-苯并吲哚、3-溴丙酸、4-二苯胺基苯甲醛为原料，设计并合成了一种能够在低pH条件下荧光增强的新型荧光探针ExoTracker。并运用1H-NMR技术和MS技术对目标化合物及中间产物的结构和分子量进行了表征。 （2）本研究对探针ExoTracker的光谱性质和细胞相容性等进行了评估。实验结果显示，ExoTracker与sEV结合后荧光强度显著增强；全波长扫描结果显示ExoTracker在550nm有最大激发波长，在670nm有最大发射波长；流式细胞术结果显示使用浓度为10μM或者50μM的ExoTracker均能对sEV进行很好标记；细胞活力实验结果显示ExoTracker在正常使用浓度范围内对细胞毒性较低；且ExoTracker标记的sEV在酸性条件下荧光强度更强。 （3）本研究对探针ExoTracker在活体生物水平的应用进行了评估。纳米粒径、透射电镜以及结构光学显微镜结果表明ExoTracker标记前后的sEV在大小、形态、结构上无明显变化；流式细胞术和荧光成像实验结果表明ExoTracker可以用于标记sEV，进而追踪sEV与受体细胞间的相互作用；扁形虫、斑马鱼及小鼠等体内实验结果表明ExoTracker具有很好的生物相容性和较好的灵敏度。 综上，本研究合成的新型荧光探针ExoTracker有望解决不能很好标记和示踪酸性条件下sEV的难题，为进一步探究sEV在疾病发生发展中的作用提供了技术支持。
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