摘要
玫瑰（Rosarugosa）是蔷薇科蔷薇属重要的落叶灌木，具有很高的观赏、食用、药用及工业价值，是一种综合利用价值很高的园林植物。玫瑰花型优美、花香馥郁，对于干旱、寒冷、病虫害等多种胁迫具有很强的抗性，在园林应用中具有很高的潜在价值。然而，玫瑰在园林绿化中的应用并不常见，这主要是因为玫瑰花色单调、花期较短。与同属植物月季丰富的花色相比，玫瑰花色单一，多数为玫红色，少数为粉色、白色，缺少黄色、橙色、红色及其它颜色，这在一定程度上制约了玫瑰在园林中的应用。前人研究表明，玫瑰中的呈色物质主要是花青苷。花青苷属于类黄酮代谢产物，广泛的存在于植物的各种组织中，是植物中最重要的呈色物质。花色苷的合成积累主要受结构基因和调节基因的控制。目前，玫瑰花青苷代谢途径中的关键结构基因已被分离克隆出来；部分调节基因，如少数MYB转录因子也被分离鉴定出来，这在一定程度上揭示了花青苷的生物合成过程。但在玫瑰花青苷合成的转录调控研究上仍留有巨大的空白，许多调控花青苷合成的关键调节基因还未被发掘，关于bHLH转录因子的研究更是未见报道。因此，分离鉴定玫瑰中与花青苷合成相关的转录因子能更好的理解花青苷在转录水平的合成调控，进而为玫瑰花色创新提供一定的理论基础。 本研究主要以‘紫枝’玫瑰（Rosarugosa‘Zizhi’）作为试验材料，从玫瑰转录组数据中挖掘出4个可能与花青苷合成相关的转录因子，并克隆得到基因的CDS全长；对基因编码的蛋白进行同源序列比对、构建系统进化树及生物信息学分析，初步了解蛋白的结构及亲缘关系；采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术，分析基因在‘紫枝’玫瑰6个组织部位及9个花发育时期的表达水平，以初步预测基因的功能；利用酵母双杂交技术验证转录因子之间的互作关系；利用转基因技术将两个bHLH基因转入烟草，以验证其生物功能。主要研究成果如下。 （1）以‘紫枝’玫瑰蕾期花瓣的cDNA为模板，首次在玫瑰中克隆得到2个MYB转录因子：RrMYB10.1、RrMYB11，和两个bHLH转录因子：RrbHLH3和RrbHLH77。其中，RrMYB10.1的ORF全长为750bp，编码249个氨基酸，基因登录号为MH717244；RrMYB11ORF全长为906bp，编码301个氨基酸，基因登陆号为MK434207；RrbHLH3的ORF全长为2109bp，编码702个氨基酸，基因登录号为MK434208；RrbHLH77的ORF全长为1662bp，编码553个氨基酸，基因登录号为MK434209。 （2）上述4个基因所编码的蛋白均具有本家族特定的保守结构域，且与其它物种中的同源蛋白具有很高的相似性。生物信息学结果显示：基因编码的蛋白均以α-螺旋（α-helix）、随机卷曲（Randomcoil）为主，属于酸性、不稳定的亲水蛋白；蛋白含有众多的磷酸化位点，无糖基化位点、信号肽和跨膜结构域，属于非分泌性蛋白。 （3）在不同花发育时期的荧光定量中，RrMYB10.1、RrbHLH77的表达量随着花瓣颜色的加深而增加，与花青苷的合成积累呈正相关趋势；而RrMYB11、RrbHLH3在蕾期初期（S1）表达量最高，随着花瓣颜色加深和花青苷含量增加，基因的表达量呈下降趋势。 （4）酵母双杂交实验结果显示RrbHLH3与RrMYB11、RrTTG1发生相互作用，预测在玫瑰中，三者通过形成三元转录复合体在玫瑰中调控原花青素的合成。而RrMYB10.1、RrbHLH77可能单独发挥作用或与其它特定的转录因子结合参与到花青苷的合成调控过程中。 （5）将RrbHLH3和RrbHLH77构建表达载体后转入农杆菌中，并利用叶盘片法将重组表达载体转入烟草植株中。
NETL