摘要
农林纤维废弃物中含有大量的木质纤维素，在含有离子液体的体系中进行“一锅法”酶解木质纤维素时，离子液体可能对纤维酶的活性与稳定性有一定的抑制作用，固定化纤维素酶是改善纤维素酶在离子液体中失活问题的重要方法之一。基于课题组前期已经开展的类芽孢杆菌sp.LLZ1纤维素酶在离子液体系中的失活研究，本研究旨在改善纤维素酶在离子液体系中的耐受性，提高其在离子液体系中对木质纤维素原位酶解的效率。主要研究内容和结果如下： 首先，研究了金属有机框架（MOF）材料作固定化载体对纤维素酶的吸附，并对固定化纤维素酶的蛋白吸附量、固定化纤维素酶的形貌特征、以及催化水解能力进行了详细地探究。结果表明：通过溶剂置换法活化MOF材料，得到活化后的四种比表面积高的材料ZIF-8、UIO-66-NH2、MIL-100-Fe和PCN-250。随后，纤维素酶被成功固定在四种MOF材料上，其中ZIF-8拥有最大的纤维素酶吸附量176.16mg/g。XRD分析表明固定化纤维素酶的晶体结构改变不大，SEM图像显示蛋白沉积吸附在MOF晶体表面。N2吸附等温线测定结果表明ZIF-8和UIO-66-NH2的吸附等温线具有Ⅳ型曲线，在较高的P/P0时具有磁滞回线，MIL-100-Fe和PCN-250的吸附等温线具有I型曲线。比表面积分析显示MOF材料比表面积很大，ZIF-8的比表面积甚至可达1414.51m2/g。最后，通过羧甲基纤维素钠（CMCNa）作为底物来探究固定化纤维素酶的催化水解能力。ZIF-8、UIO-66-NH2、MIL-100-Fe和PCN-250固定化酶的催化水解能力（CMC酶活）分别为游离酶的94%、94.2%、105.5%和102.8%。固定化纤维素酶的最佳反应条件测得为40℃，pH=5。 其次，研究了离子液体的预处理效果、MOF固定化酶在离子液体中的耐受性、失活动力学、原位糖化生物质效果以及循环利用性能。并进行了如下具体研究：实验首先考察了九种离子液体（IL）包括[Emim]OAc，[Emim]DEP，[Emim]Cl，[Emim]Br，[Bmim]OAc，[Bmim]Cl，[DEMA]OAc，[Ch]OAc和[TEA]OAc预处理生物质从而分析IL的预处理效果，对预处理后的甘蔗渣（BG）在浓度25％（v/v）的不同IL中催化反应产生的还原糖产量进行分析，选择最优IL体系为[Emim]DEP。接下来，对固定化酶的耐IL特性进行分析，结果表明固定化纤维素酶在IL中相对游离酶更加稳定，在50％（v/v）[Emim]DEP中，ZIF-8固定化酶具有8.5倍于游离纤维素酶的滤纸酶活性（FPase）活性。进一步的，通过FT-IR分析和酶失活动力学曲线研究了固定化纤维素酶在IL中的失活机制，固定化酶具有较低的kd（平衡解离常数）值和较高的ap（最终酶平台活性）值。同时，固定化纤维素酶在IL中原位酶解生物质的效果也被探究，数据表明，在50％（v/v）的[Emim]DEP体系中ZIF-8，UIO-66-NH2，PCN-250和MIL-100-Fe固定化酶原位糖化甘蔗渣（BG）产糖量相对游离纤维素酶均有提高，分别增加了92.92％，81.51％，54.11％和21％。固定化纤维素酶的重用性也通过多次回收再利用来评估，将滤纸（FP）纤维素作为底物研究固定化纤维素酶的重复利用性，固定化纤维素酶在25％（v/v）的[Emim]DEP中第四次重复使用时残留活性为初始活性的61.33%。 最后，为进一步提升ZIF-8固定化纤维素酶的离子液体耐受性和循环使用性能等，研究分别制备了两种功能化MOF材料Chitosan@ZIF-8和PEG@ZIF-8，对功能化MOF、功能化MOF固定化酶进行表征，同时对功能化MOF的蛋白吸附能力、功能化MOF固定化酶的原位糖化能力、耐离子液体能力和循环利用性方面进行研究。具体研究包括如下：功能化ZIF-8的热重分析和Zeta电位分析表明，功能化MOF材料的热稳定性很高，壳聚糖和PEG修饰后的ZIF-8的Zeta电位往正电荷方向移动。对功能化ZIF-8固定化酶进行X-射线衍射（XRD）、傅里叶红外光谱（FT-IR）、粒径分布的表征，ZIF-8表面功能化后XRD和FT-IR的特征峰位置及强度几乎无明显变化，但固定化纤维素酶后，特征峰的强度均有变化。进一步，对功能化载体材料的吸附蛋白能力进行分析，Chitosan@ZIF-8和PEG@ZIF-8对酶蛋白的吸附能力相对ZIF-8增加了69.46%和37.32%。同时，功能化ZIF-8固定化酶的原位糖化能力和循环利用性方面，比ZIF-8固定化酶的优越性更明显，在50％（v/v）的[Emim]DEP中固定化纤维素酶原位水解BG产还原糖量（mg/mL）为Chitosan@ZIF-8（0.212）＞PEG@ZIF-8（0.1509）＞ZIF-8（0.129），以FP为水解底物的循环利用实验中，Chitosan@ZIF-8固定化酶在25%（v/v）[Emim]DEP中第五次循环利用时剩余活性为初始活性的71.38%，比ZIF-8固定化酶的剩余活性高出72.71%。
NETL