摘要
目的：何首乌作为当今临床应用十分广泛的中药材来说，具有补益肝肾的功效，但在用药过程中出现的肝损伤反应引起了国内外学者们的广泛关注。在中医药基础理论中，通常以证候阐述具体的疾病；不同证候对同一种疾病的易感程度存在着差异；中药的偏性也会导致机体状态产生相应的变化，我们将中医与中药进行结合，探究两者在造成药物性肝损伤时是否存在关联性。本试验在课题组前期对肾虚证候与何首乌致肝损伤的研究基础上增加新的中医证候，旨在探究肾阴虚、肾阳虚、实热证、虚寒证四种中医证候与何首乌及其炮制品致肝损伤的内在联系，研究何首乌致肝损伤的易感证候，为后期何首乌的临床用药提供合理可靠的依据。 方法：1.以SD大鼠为研究对象，分别建立肾阴虚、肾阳虚、实热证、虚寒证模型，造模完成后观察各组大鼠的形态学变化，利用Elisa技术检测血清指标，验证造模是否成功。 2.取27只造模成功的SD大鼠，随机分为9组（空白组、肾阴虚＋生首乌组、肾阴虚＋制首乌组、肾阳虚＋生首乌组、肾阳虚＋制首乌组、实热证＋生首乌组、实热证＋制首乌组、虚寒证＋生首乌组、虚寒证＋制首乌组），每组3只，连续灌胃给药7天，制备含药血清。以HepG2细胞为体外研究对象，空白组大鼠含药血清筛选细胞最佳作用时间及作用浓度，采用CCK-8法、AnnexinV-FITC/PI法测定生首乌和制首乌不同证候给药组含药血清对HepG2细胞的凋亡率及凋亡诱导情况；通过RT-PCR技术检测NF-κBp65/TNF-α/CYP2E1、PXR/CYP3A4通路的基因表达情况。 3.取78只造模成功的SD大鼠，随机分为13组（空白组、肾阴虚模型组、肾阳虚模型组、实热证模型组、虚寒证模型组、肾阴虚＋生首乌组、肾阴虚＋制首乌组、肾阳虚＋生首乌组、肾阳虚＋制首乌组、实热证＋生首乌组、实热证＋制首乌组、虚寒证＋生首乌组、虚寒证＋制首乌组），每组6只，连续灌胃4周，取肝脏组织进行HE染色，观察组织病理变化程度；RT-PCR技术检测NF-κBp65/TNF-α/CYP2E1、PXR/CYP3A4的基因表达情况；WesternBlot技术检测各组细胞中NF-κBp65/TNF-α/CYP2E1、PXR/CYP3A4蛋白表达情况。 结果：1.造模完成后，肾阴虚模型组大鼠血清cAMP、T3、T4、cAMP/cGMP的表达相对于空白组呈现升高趋势，cGMP的表达则呈现下降趋势，均具有统计学差异（p＜0.05）；肾阳虚模型组cAMP、T3、T4、cAMP/cGMP相对于空白呈现下降趋势，具有统计学差异（p＜0.05）；实热证模型组大鼠血清cAMP、T3、T4、cAMP/cGMP整体升高，相对于空白组具有显著性差异（p＜0.05）；虚寒证模型组大鼠血清cAMP、T4、cAMP/cGMP含量下降，相对于空白组具有显著性差异（p＜0.05）。 2.给予生首乌、制首乌水煎液后，各证候组大鼠含药血清对于HepG2细胞的生长产生了不同程度的抑制。生首乌给药组中，四种证候组与胎牛血清组相比均产生了显著的抑制性（p＜0.05），其抑制程度分别为肾阳虚组（25.15%）＞肾阴虚组（23.69%）＞虚寒证组（16.28%）＞实热证组（9.47%）。制首乌给药组中，其抑制程度分别为肾阳虚组（13.24%）＞肾阴虚组（10.32%）＞虚寒证组（8.99%）＞实热证组（4.86%），除实热证组外，其余证候组与胎牛血清组相比均具有显著性差异（p＜0.05）。各组的细胞形态发生了一定的变化，均出现破裂、坏死的情况； 细胞AnnexinV-FITC/PI检测结果显示，不同证候给药组的含药血清作用于HepG2细胞后，各组细胞均产生了不同程度的早凋，晚凋和坏死情况。生首乌给药下，四种证候组含药血清均对细胞的凋亡产生诱导，且与空白组相比具有统计学差异（p＜0.05）。制首乌给药时，肾阴虚、肾阳虚、虚寒证组也对细胞产生凋亡诱导，与胎牛血清组相比具有统计学差异（p＜0.05）；空白组与正常胎牛血清组对细胞的凋亡诱导情况一致，无统计学差异（p＞0.05）。 RT-PCR结果显示，生首乌给药组中，肾阴虚、肾阳虚组、虚寒证PXR表达量与空白组相比下降，NF-κBp65、TNF-α、CYP2E1、CYP3A4的表达量则升高（p＜0.05）。实热证组的指标变化情况与空白组相比不具有统计学差异。制首乌给药组情况与生首乌组相同。 3.给予各模型组相同剂量的生首乌、制首乌水煎液后，对其肝脏组织进行HE病理切片观察，结果显示空白组大鼠的肝细胞结构完整，无变性，无炎性细胞浸润；肾阴虚生首乌、肾阳虚生首乌、虚寒证生首乌组肝细胞明显出现局灶性脂肪变性，包浆疏松，肝细胞变性；肾阳虚制首乌组可见轻度变性，细胞包浆淡染。 RT-PCR技术检测，生首乌给药时，肾阴虚、肾阳虚、虚寒证给药组大鼠肝脏PXR表达量下降，NF-κBp65、TNF-α、CYP2E1、CYP3A4的表达量则显著升高，与空白组相比具有统计学差异（p＜0.05）；制首乌给药后情况与生首乌给药相同。 经WesternBlot技术检测，生首乌给药时，肾阴虚、肾阳虚、虚寒证组大鼠肝脏中PXR的蛋白含量显著降低，NF-κBp65、TNF-α、CYP2E1、CYP3A4蛋白含量则显著升高，与空白组相比具有统计学差异（p＜0.05）。制首乌给药时情况与生首乌相似。 结论：1.皮下注射氢化可的松注射液50mg/kg、7天可造成大鼠肾阴虚证候；皮下注射氢化可的松注射液25mg/kg、15天可造成大鼠肾阳虚证候；灌胃给大鼠黄芪-党参（1∶1）水煎液15天可造成实热证证候；肌肉注射氢化可的松琥珀酸钠20mg/kg、15天可造成大鼠虚寒证证候；该方法造成的中医证候大鼠模型稳定可靠，可应用与具体实验操作。 2.肾阴虚、肾阳虚、虚寒证、实热证在面对生首乌时，可能会诱导肝损伤的情况加重，其中肾阳虚证候较为严重其次为肾阴虚证候、虚寒证证候，实热证对生首乌致肝损伤的诱导情况不明显。 3.肾阴虚、肾阳虚两种证候对制首乌也存在一定的肝损伤诱导情况，但其程度整体低于生首乌，虚寒证和实热证对其致肝损伤的诱导也呈现一定的趋势，但并未表现出统计学差异。
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